Diapositive 1

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Master CPMI
Spectrométrie de masse SM
Enseignant Y. FRANCOIS
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Yannis FRANCOIS Laboratoire de Dynamique et
Structure Moléculaires par Spectrométrie de
Masse Tour de Chimie, 12ème étage e-mail
yfrancois_at_unistra.fr
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Spectrométrie de masse
1. Présentation générale 2. Instrumentation et
principe de la mesure 2.1. les sources
d'ions 2.2. les analyseurs 2.3. les
détecteurs 2.4. Principe de la
fragmentation 3. Le couplage LC GC/MS 4.
Applications
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Quest-ce que la spectrométrie de masse ?

• Méthode analytique permettant de peser les
  molécules avec une très grande précision.
• On détermine sa masse moléculaire

• Exemple dapplication
• Rechercher le signal dun composé donné dans un
  mélange complexe (CO ds latmosphère de Titan ou
  un dopant ds les urines)
• ? Obtenir une 1ere donnée sur une molécule
  inconnue (molécule extraite dune plante
  médicinale)

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Principe de la spectrométrie de masse ?

• Méthode analytique permettant de mesurer la
  masse des molécules par rapports à leur nombre de
  charge

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Comment peser une molécule ?

• Travailler en phase gazeuse où les molécules
  sont isolées

• Travailler avec des molécules chargées

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• Un spectrométre de masse
• mesure la masse de molécules isolées
•  
• Trois étapes  

• 1- Volatiliser
• Séparer les molécules les unes des autres
• Passer de létat de matière condensée à un état
  gazeux

•  2- Ioniser
• Transformer les molécules en ions
• Utilisation dun champs électriques

•  3- Analyser
• Calculer masse moléculaire à partir du rapport
• m / z masse / nb de charges

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Quelle masse mesure-t-on ?
Masse monoisotopique cest la masse  exacte  du
premier pic du profil isotopique cest-à-dire
celle qui ne prend en compte que les masses des
isotopes les plus stables (C12, H1, O16, S32,
N14, ).

• Masse chimique ou moyenne
• cest le barycentre des masses des pics
  constituant le profil isotopique cest-à-dire la
  masse qui prend en compte la masse des éléments
  donnée par le tableau périodique (C12,011).

La masse s exprime en Dalton (Da) Elle dépend
de la résolution du spectromètre de masse
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m en Dalton (Da) ou unité de masse atomique
1 Da 1/12 .12 . 10-3 kgmole-1 / N
(N 6, 022045 . 1023) Et donc 1 Da 1,66
. 10-27 kg
C12 12,000000000 O16 15,9949146 C13
13,003354839 S32 31,9720718 H1
1,0078250 N14 14,0030740 H2
2,0141018 Cl35 34,968852729
Le rapport m/z sexprime en Thomson (Th)
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Le spectromètre de masse
Système d'introduction
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Spectrométrie de masse
1. Présentation générale 2. Instrumentation et
principe de la mesure 2.1. les sources
d'ions 2.2. les analyseurs 2.3. les
détecteurs 2.4. Principe de la
fragmentation 3. Le couplage LC GC/MS 4.
Applications
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La source dions son rôle est de volatiliser et
dioniser
Il existe de nombreux types de sources dions et
chacun de ces types de sources repose sur un
principe physique différent.   Le principe
physique qui permet de volatiliser et dioniser
un type de composé est choisi par lopérateur en
fonction des caractéristiques de la molécule à
analyser. Les étapes de volatilisation et
dionisation se font successivement ou
simultanément selon le type de source.

• Les critères de choix principaux sont
• la volatilité et la stabilité thermique du
  composé à analyser
• les fonctions chimiques présentes et leur
  aptitude à induire une ionisation
• la taille des molécules
• les quantités de produit disponibles
• le type dintroduction souhaitée (directe ou en
  couplage chromatographique)

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Lionisation laser assistée par matrice Matrix
Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI)

• Le MALDI est basé sur lutilisation dun composé
  (la matrice) qui absorbe à 337 nanomètres
• Lénergie va être transféré à léchantillon par
  la matrice
• Léchantillon ionisé va être transféré dans
  lanalyseur

Génère des ions à une seule charge
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Principe MALDI-MS
Mélange matrice/échantillon
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Principe MALDI-MS
Mélange matrice/échantillon
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Principe MALDI-MS
Laser
Echantillon ionisé
Analyseur
Matrice ionisé
Mélange matrice/échantillon
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La cible MALDI
Dépôt dun échantillon (1 µl)
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Préparation de léchantillon en MALDI-MS

solution de matrice acide a-cyano-4-hydroxycinn
amique dans eau 0,1 TFA/acétonitrile (50/50)
solution d échantillon eau 0,1
TFA/acétonitrile (50/50)




. . . . . .
. . . . . .

Cible

• Lanalyte est dilué environ 10 000 fois dans
  cette matrice
• Evaporation lente et totale des solvants
• Formation de gros cristaux de matrice
• Pas de couplage avec la chromatographie possible

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Caractéristiques de la matrice

1. De faible masse moléculaire (faciliter la
   vaporisation)
2. Acide (agissant comme source de protons)
3. Forte absorption dans lUV (absorbe lirradiation
   laser)
4. Fonctionnalisée avec des groupes polaires
   (travail en solution aqueuse)

• Rôle
• Protéger lanalyte de la destruction par un
  faisceau laser directe
• Faciliter sa vaporisation et son ionisation.

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Matrices couramment utilisées en MALDI-MS Elles
absorbent à 337 nm et cristallisent facilement
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Le spectromètre de masse
Système d'introduction
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Notion de libre parcours moyen
Le spectromètre de masse doit être sous un vide
poussé car il faut limiter les collisions entre
les ions à analyser et les molécules de gaz
résiduelles - déviation de l'ion de sa
trajectoire - réactions non désirées
(fragmentation de l'ion)
Libre parcours moyen distance minimale entre 2
chocs à une pression donnée
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Les caractéristiques principales d'un analyseur
sont

• La résolution R
• La gamme m/z qu'il peut analyser
• La rapidité de balayage en m/z
• La sensibilité
• La vitesse avec laquelle les ions le traversent

Souvent, avec un même analyseur, on peut
augmenter l'une de ces caractéristiques aux
dépens des autres, mais seulement dans certaines
limites.
Chaque type d'analyseur a son "point fort"
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Résolution R
R mesure laptitude dun analyseur à distinguer
des ions séparés par DM Dalton (lion M de lion
MDM)
R M/?M
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Lanalyseur à temps de vol (TOF)
Séparation des ions en fonction de leur vitesse
lorsquils se déplacent dans une zone libre de
champs (tube de vol)
Deux types de mode dutilisation Mode
linéaire et mode réflectron
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Lanalyseur à temps de vol (TOF)

• Les ions arrivent avec leur Ec (mv2/2) dans une
  zone libre de champs
• Les plus légers sont plus rapides
  1er détectés
• Les plus lourds sont plus lents
  derniers détectés

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Lanalyseur à temps de vol (TOF)
Mode linéaire
Détecteur
- 100 V
Région dionisation
100 V
0 V
4200 V
3700 V

• Calcul du rapport m/z en fonction du temps que
  met lion à parcourir le tube de vol
• Vitesse danalyse extrêmement rapide
• Limite de masse gt 1 000 000, mais résolution
  5000
• Inconvénient Effet dispersif de lEc, baisse
  de la résolution

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Lanalyseur à temps de vol (TOF)
Mode réflectron
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Le spectromètre de masse
Système d'introduction
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Le détecteur pour compter les ions
Multiplicateur délectron (détecteur le plus
courant) Principe dopage du signal par la
formation délectron secondaire à laide de tubes
en verres dopés au plombs (dynode) Avan
tage bonne sensibilité et balayage
rapide Inconvénient moins précis que le
cylindre de Faraday, durée de vie limité
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Spectrométrie de masse
1. Présentation générale 2. Instrumentation et
principe de la mesure 2.1. les sources
d'ions 2.2. les analyseurs 2.3. les
détecteurs 2.4. Principe de la
fragmentation 3. Le couplage LC GC/MS 4.
Applications
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La fragmentation
Principe consiste à  casser  une molécule à
lintérieur dun spéctromètre de masse, afin de
déterminer ses propriétés structurales
La MS-MS est un puissant outil de détermination
de structure
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La spectrométrie de masse à plusieurs dimensions
MS-MS
Mélange complexe dions
Source Ion
Introduction
Détecteur
V
ESI MALDI
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La fragmentation
Rôle du premier analyseur sélectionne les ions
avec un certain m/z (ion parent) Purification
dun ion présent dans un mélange complexe
Rôle de la chambre de collision cellule dans
laquelle lion parent va être fragmenté pour
donner les ions fils Exemple Présence dun gaz
qui va induire par collision des fragmentations
Rôle du deuxième analyseur mesure les m/z des
fragments
Répétition de lopération MS-MS-MS ou MS3 etc.
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La spectrométrie de masse à plusieurs
dimensions couplée à la HPLC LC-MS-MS
Système d'introduction
Cellule de collision
Source
MS1
MS2
Détecteur
Formation Ions en phase gazeuse
Sélection du parent
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La spectrométrie de masse à plusieurs
dimensions couplée à la HPLC LC-MS-MS
Système d'introduction
Cellule de collision
Source
MS1
MS2
Détecteur
Fragmentation du parent
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La spectrométrie de masse à plusieurs
dimensions couplée à la HPLC LC-MS-MS
Système d'introduction
Cellule de collision
Source
MS1
MS2
Détecteur
Formation des ions fils
Détection MS/MS
Focalisation des ions fils
Séparation des ions fils
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Spectrométrie de masse
1. Présentation générale 2. Instrumentation et
principe de la mesure 2.1. les sources
d'ions 2.2. les analyseurs 2.3. les
détecteurs 2.4. Principe de la
fragmentation 3. Le couplage LC GC/MS 4.
Applications
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Application 2
Application de la SM dans le domaine de la
santé découverte de nouvelles cibles
diagnostiques ou thérapeutiques validation de
nouveaux médicaments
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Application 2 Analyse protéomique différentielle
par électrophorèse bidimensionnelle
Etat A
Etat B
pH 3.0
pH 10.0
pH 3.0
pH 10.0
200 kDa
10 kDa
Rétine normale
Rétine pigmentée
Molecular and Cellular Proteomics, 2, 494-505,
(2003).
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Application 2 Analyse protéomique différentielle
par électrophorèse bidimensionnelle
Etat A
Etat B
pH 3.0
pH 10.0
pH 3.0
pH 10.0
200 kDa
10 kDa
Excision du spot dintérêt
Identification de la protéine Par spectrométrie
de masse
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Application 2 Analyse protéomique différentielle
par électrophorèse bidimensionnelle
Etat A
Etat B
pH 3.0
pH 10.0
pH 3.0
pH 10.0
200 kDa
10 kDa
Problème Limitation par la gamme de masse
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La précision de mesure de masse Une nécessité
en protéomique !
C-ter
N-ter
Protéine dintérêt
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La précision de mesure de masse Une nécessité
en protéomique !
2
1
C-ter
N-ter
1234.68
606.14
Protéine dintérêt
875.46
1002.27
550.45
1. Génération de peptides par action dune
enzyme spécifique (trypsine)
2. Mesure de la masse moléculaire de chaque
peptide avec une précision de qques ppm !
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La précision de mesure de masse Une nécessité
en protéomique !
2
1
C-ter
N-ter
1234.68
606.14
Protéine dintérêt
875.46
1002.27
550.45
1. Génération de peptides par action dune
enzyme spécifique (trypsine)
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Interrogation dans les banques de données
2. Mesure de la masse de chaque peptide
3. Existe t-il dans les banques de données une
protéine dont certains peptides trypsiques ont la
même masse (à / - 0,xx Da) que certains des pics
mesurés?
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Application 2 Analyse protéomique différentielle
par électrophorèse bidimensionnelle
Liste de masses expérimentales
Génome
373.23 424.20 474.29 507.25 537.32 581.31 638.38 8
46.22 863.45 864.40 716.38 992.41
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Exemple de recherche sur MS-Fit (mesures ESI)
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MS-Fit donne la liste des peptides reconnus par
leur masse moléculaire et la séquence
correspondante
49
Résultats d'une recherche .