Tema 14.

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Tema 14.

• Taxonomía molecular

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• Filogenia molecular basada en marcadores
  moleculares el ADNr procariota, 16S, 23S el
  ADNr eucariótico 18S, 28S y 5,8. Métodos de
  fingerprinting ITS, RAPD, ARDRA, BOX, REP, ERIC,
  ribotyping, ADN mitocondrial. Métodos de estudios
  basados en el ADN de comunidades microbianas
  FISH, DGGE, T-RFLP. Bioinformática. Concepto e
  Importancia. Bases de datos en Internet NCBI,
  EMBL. Software (DNAman, MEGA 4, Treeview) y
  Programas on line para análisis de secuencias
  Workbench Biology, Eztaxon Server, Ribosome
  DataBase Project, NCBI. Algoritmos de
  comparación BLAST. Construcción de Árboles
  Filogenéticos.

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• La taxonomía estudia los principios de
  clasificación de los organismos según las
  semejanzas y diferencias de sus caracteres.
• La sistemática trata de los resultados que se
  obtienen al aplicar tales principios

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• Las unidades sistemáticas de cualquier categoría
  se designan con el nombre de taxones o estirpes
• Las especies que poseen una serie de caracteres
  comunes se agrupan en Géneros, éstos de forma
  análoga en Familias
• Órdenes,
• Clases
• Divisiones.

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• Dentro de las especies suelen distinguirse
  Subespecies, Variedades, Líneas y Clones o Cepas.
  
• Población de células genéticamente idénticas,
  procedentes de una sola

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• Tradicionalmente hemos visto la biodiversidad
  relativa a nuestra escala de conocimiento.
  Nuestra especie es una dentro de 12.500.000 que
  ahora existe y muchos que existieron en el
  pasado.
• Estas especies se han desarrollado durante un
  periodo de 3.800.000.000 años. Durante la mayor
  parte de este tiempo las formas han existido las
  formas microbianas.

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• De los 3 dominios de la vida, 2 son
  exclusivamente procariotas, pero ellos contienen
  solamente alrededor de 5000 especies conocidas.
• Muchas mas especies microbianas son conocidas
  entre los eucariotas, pero aun muchas menos que
  el número de especies animales

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• Mucha de la biodiversidad no es vista por
  nosotros y fue totalmente desconocida hasta antes
  de la invención del microscopio por Van
  Leeuwenhoek en el siglo XVII.
• De acuerdo con la tradición, todas las cosas
  vivas fueron ubicadas en reinos animal y reino
  vegetal.
• Cuando los microbios aparecieron, fueron puestas
  dentro de este sistema bacterias, hongos y algas
  como las plantas y protozoos como animales.
• Llegaron cambios necesarios para acomodar las
  diferencias fundamentales tales como las células
  eucariotas y procariotas.

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• Los Macro-organismos se desarrollaron a partir de
  los microbios y fueron capaces de extender la
  vida regiones desérticas de la tierra, creando
  los nuevos hábitat para los microbios en el
  proceso.
• Esto fue relativamente reciente en la evolución.

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• Relativamente poco de la diversidad microbiana
  existente es conocido por el hombre.
• Esto significa que hay un potencial enorme para
  encontrar los nuevos recursos para la
  biotecnología.

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• Echemos una ojeada breve algunos de los grupos
  microbianos que se conocen en la actualidad
• La diversidad de los organismos vivos es tan
  grande que no hay definición simple de especie
  aplicable a todos los grupos.
• Esto hace que sea imposible hacer una comparación
  significativa de diversidad entre diferentes
  grupos.

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Definición taxonómica de las especies

• En microbiología - especialmente en bacterias y
  levaduras grupos genéticamente aislados de
  organismos altamente similares (los criterios son
  descendiente fértil del acoplamiento, como en la
  especie biológica, o la semejanza del genoma en
  más del 70 basada en hibridaciones cuantitativas
  in vitro de ADNn/ADNn, o la alta semejanza en
  base a secuencias de ciertas regiones homólogas
  del ADN).

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• La especie biológica - sobre todo desarrollada
  por los zoologistas Dobzhansky 1937 " las
  especies son sistemas de poblaciones el
  intercambio de genes entre estos sistemas esta
  limitado o prevenido por un mecanismo de
  aislamiento reproductivo o quizás por una
  combinación variada de dichos mecanismos."

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• Las especies filogenéticas - un grupo
  monofilogenético integrado por el conjunto
  diagnosticable más pequeño de organismos
  individuales dentro de los cuales hay un patrón
  parental de la ascendencia y de descendencia.
  (Cracraft, 1983).

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Estimaciones del número de especie descripta y de
especie posible de microorganismos no
descriptas.(World Conservation Monitoring
Center, 1992, Global Biodiversity,D. L.
Hawksworth and R. R. Colwell)
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Grupo Especies Descriptas Especies estimadas
Con. Algas 40.000 350.000
11.0 Bacterias 4.000 3.000.000
0,1 (incluye no cultivables) Hongos 70.000
1.500.000 5,0 Protozoarios 40.000
100.000 40.0 Virus 5.000 500.000
1.0 (incluye plásmidos, fagos etc.) Total
159.000 5.450.000 3.0
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• La verdadera dimensión de la diversidad
  microbiana fue reconocida recién en las pasadas
  décadas con el desarrollo de métodos genéticos
  molecular.

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• Cronómetros evolutivos
• Macromoléculas celulares que ayudan a medir
  cambios evolutivos
• De Distribución universal
• Funcionalidad homólogo
• Alineación apropiada de las secuencias
• Índice de cambios lento
• Secuencias de Citocromos Ferredoxinas
  Otras proteínas (ATPasas, RecA) ARNs

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• El ARN Ribosomal como cronómetro evolutivo
• Moléculas antiguas
• Funcionalmente constante
• Distribuido universalmente
• Moderado secuencias conservadas
• Gran número de secuencias disponibles

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• Huella dactilar molecular
• ARDRA
• RFLP by PFGE
• RAPD
• ITS
• t-DNA
• Secuenciado de ARNr
• Perfil Plasmídico
• SSCP
• Huella dactilar para comunidad
• FISH
• DGGE
• T-RFLP
• Real time-PCR

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(No Transcript)
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(No Transcript)
23
rRNA operon of Prokaryotes

• 5S rRNA (120 nucleótidos)
• 16S rRNA (1500 nucleótidos)
• 23S rRNA (2900 nucleótidos)

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Operon ARNr
25
(No Transcript)
26
(No Transcript)
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Operon ARNr de Eucariotas

• 5.8S ARNr
• 18S ARNr
• 28S ARNr

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Árbol filogenético

• Distancia distancia evolutiva, basada en las
  diferencias
• Parsimonia (Parsimony) mínimos cambios en la
  líneas de un ancestro común

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• Filogenia tentativa de los eucariotas basado en
  la secuencia ribosomal y comparaciones (Perry
  Staley 1997)

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Biodiversidad
Métodos Convencionales
Métodos Moleculares
Extracción de ADN total
Screening, enriquecimiento aislamiento
Evolución Directa
Librerías de Colección
Identificación y caracterización
Cultivos puros
Screening, enriquecimiento aislamiento
Expresión de la/las enzimas de interés
Evaluación de los procesos
Librerías metabólicas
Optimización de producción
Transferencia
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Secuencia de ADNr de un cultivo de microorganismo
puro
BACTERIA
ADN AISLADO
5
Cebadores universales para PCR
Gel de agarosa
Tamaño correcto Banda simple
Secuenciado
Análisis de la secuencia
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Cultivos no individiuales
Comunidades microbianas
Microorganismo aislado
ADN AISLADO
5
Clonado Cebadores específicos para
PCR Secuenciado Análisis de las secuencias
T-RFLP DGGE FISH Real-time PCR
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(No Transcript)
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Pulsed field gel electrophoresis PFGE
ADN cromosomal obtenido por PFGE de cepas de Z.
mobilis digeridas con NotI (a) y SfiI (b). Lanes
M, Mid. Range I Molecular Weight PFGE Marker 1,
PROIMI A1 2, ATCC 10988T 3, ATCC 29191 4, ATCC
29192T.Migration conditions 3 V cm-1, 9 s, 40 h.
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RAPDRandom Amplification of Polymorphic DNA
RAPD analysis of Z. mobilis strains. Lanes M1,
Molecular Weight Marker 100 bp DNA Ladder M2, 1
kb DNA Step Ladder 1, PROIMI A1 2, ATCC 10988T
3, ATCC 29191 4, ATCC 29192T. Primers used (a)
UBC4 (b) B6 (c) B7 (d) B9 (e) A8.
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SSCP Single-Strand Conformation Polymorphism

• SSCP is the electrophoretic separation of
  single-stranded nucleic acids based on subtle
  differences in sequence (often a single base
  pair) which results in a different secondary
  structure and a measurable difference in mobility
  through a gel.

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• El proceso usado durante el desarrollo de SSCP
  fue el siguiente
• Digestión del ADN total con enzimas de
  rectricción
• Desnaturalización en solución alcalina
• Electroforesis sobre gel de poliacrilamida neutro
  
• Transferencia a una membrana de nylon
• Hibridización con otro fragmento de ADN o mas
  claro empleando copias de ARN sintetizadas sobre
  cada cadena usadas como sondas (Orita et al.,
  1989).

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DGGE (Denaturing Gradient GelElectrophoresis)
39
(No Transcript)
40
Aplicaciones de la técnica de DGGE.
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• Estudiar diversidad de microorganismos
  ambientales en una comunidad compleja (16S rDNA)
  o diversidad de genes catabólicos.
• Estudiar las poblaciones con actividad metabólica
  o genes activos por análisis de productos de
  RT-PCR
• Estudiar la distribución espacial y temporal de
  poblaciones bacterianas
• Monitoreo en el tiempo
• Analizar como varía la composición de las
  poblaciones frente a cambios ambientales
  (contaminación, clima, perturbación)

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• Buscar microorganismos indicadores y
  específicos
• Monitorear la liberación de microorganismos
  genéticamente modificados
• Screening de mutaciones en genes específicos
  diagnóstico de
• enfermedades

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• Ventajas
• - La secuenciación individual de bandas puede
  revelar información filogenética ? se evita la
  clonación y la selección previa secuenciación
• - Análisis de hibridación de los perfiles con
  sondas específicas de grupo (Agrobacterium
  tumefasciens)
• - Se pueden correr simultáneamente fragmentos
  patrones correspondientes a grupos o especies
  específicas ?
• identificación directa
• - El bandeo complejo puede reducirse usando
  primers específicos de grupo (cyanobacterias,
  agrobacteria, actinomycetes)

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• Ventajas
• Amplificar fragmentos de genes funcionales
  presentes en grupos particulares de bacterias
  (NiFe hidrogenasas en Desulfovibrio)
• Análisis simultáneo de gran cantidad de
  muestras en poco tiempo (2 geles simultáneos con
  30 calles c/u en 3 hs)
• Se pueden identificar las bandas si se corren
  simultáneamente patrones específicos

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• Desventajas
• No se pueden correr más de 500 pb
• Existen diferencias gel a gel, pero las
  posiciones relativas de las bandas permanecen
  estables
• Hasta que una banda en el gel es verificada, la
  sola posición en el gradiente no tiene
  significado
• No es posible separar fragmentos de DNA con
  cierta cantidad de variación de secuencia

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• Desventajas
• Se pueden observar bandas dobles como
  resultado de la presencia de bases balanceantes
  en primers degenerados solamente muestra los
  fragmentos de DNA de las especies predominantes
  de la comunidad (se estima que las bacterias que
  estén en proporción superior al 1)
• La microheterogeneidad de secuencias y la
  presencia de múltiples operones pueden llevar a
  una sobrestimación del nº de bacterias de una
  comunidad.

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• Limitaciones de la técnica
• 1. Manipuleo en la toma de la muestra
  condiciones de muestreo y mantenimiento de la
  muestra
• 2. Extracción de ácidos nucleicos lisis
  reproducible de todas las bacterias, remoción de
  sustancias que inhiben la reacción de PCR (ács.
  húmicos, exopolisacáridos)
• 3. Reacción de PCR
• - Amplificación diferencial o preferencial (por
  renaturalización del templado)
• - Formación de heterodúplex (renaturalización de
  productos de PCR)

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• Conclusiones
• ? DGGE ofrece una rápida detección de las
  poblaciones predominantes
• AMPLIFICABLES.
• ? Detecta rápidamente diferencias en las
  secuencias de fragmentos de genes homólogos
  amplificados por PCR.

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Diferentes etapas para el análisis de comunidades
microbianas con el DGGE
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Terminal-restrictionfragment lengthpolymorphism
(T-RFLP)
Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism
(TRFLP or sometimes T-RFLP) is a molecular
biology technique for profiling of microbial
communities based on the position of a
restriction site closest to a labeled end of an
amplified gene. The method is based on digesting
a mixture of PCR amplified variants of a single
gene using one or more restriction enzymes and
detecting the size of each of the individual
resulting terminal fragments using a DNA
sequencer
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Por que nos enfocamos en el ARNr

• RNA content/cell
• 80 del ARN celular es ARNr
• 15 del ARN celular es ARNt
• 5 del ARN celular es ARNm

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Aspecto microbiano de la biodiversidad

• Es imposible de cuantificar la abundancia de un
  organismo no cultivable
• La posibilidad para realizar genómica ambiental
  abre una perspectiva para determinar el potencial
  fisiológico de microorganismos no cultivables

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Precauciones

• Saber que la heterogeneidad del gen ARNr debe ser
  por arriba del 5-6 de la secuencia disimilar
  (Haloarcula, Thermobispora)
• El estudio apropiado debe contribuir con un buena
  calidad de secuencia de ARNr (p.e. evitando
  artefacto de PCR) debe ser conducido por una
  muestra bien documentada desde los sitios
  característicos, preferentemente acompañado por
  cultivos y experimentos de hibridización

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Por que buscar la diversidad microbiana

• Estrategias y limites de vida
• El rol de los microorganismos en los ciclos
  biogeoquímicos
• Una fuente de biotecnología
• Para el monitoreo de cambios medioambientales
• Para la protección de los organismos superiores
• Para el entendimiento de la ecología y los
  principios de evolución

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Cómo determinar diversidad microbiana

• Análisis de secuencias randomizadas inserto en
  los clones
• Hibridización con sondas taxón específicas
• RFLP
• ARDRA
• DGGE
• TGGE
• T-RFLP

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Terminal-restriction fragment lengthpolymorphism
(T-RFLP)

• Técnicas de cultivos independientes para el
  seguimiento de comunidades microbianas
• Basado en amplificació por PCR de marcadores
  genéticos de ARNr 16s
• Aspectos a considerar 1) limites de detección,
  2)
• reproducibilidad, 3) cuestiones biológica para
  tratar diversidad total
• Miembros predominantes
• Dinámica de la población, etc

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Cebadores marcados fluorescentemente

• Pares de cebadores universales FAM63F and
  HEX1389R (numerados por E. coli)
• De acuerdo al sistema de seguimiento, el mas
  usado para estudios ecológicos
• Regiones mas amplificadas del gene ARN16s

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Protocolo para T-RFLP

• 1. Extracción del ADN de la comunidad o muestras
  de ARN medioambientales
• 2. Amplificación por PCR del gen ARNr 16s con
  cebadores fluorescentes
• 3. Digestión con enzimas de restricción (ej.
  CfoI, AluI)
• 4. Detección y determinación del tamaño de los
  fragmentos terminales marcados por electroforesis
  capilar o en gel
• CfoI profile

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Perfil del T-RFLP

• Electroferograma
• Diferentes fragmentos provienen de diferentes
  organismos
• Diversos organismos pueden compartir un tamaño
  común de fragmento terminal
• La Altura de pico en principio correlacionado a
  la abundancia del grupo de organismos (?)

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Los Pro y contra de T-RFLP

• LIMITACIONES
• Predispocisión inherente a los fundamentos
  técnicos de PCR
• Datos generados dependientes de la elección de
  enzima de restricción
• Un grupo grande de organismos puede compartir el
  mismo tamaño terminal del fragmento
• El tamaño evidente puede diferenciar de tamaño
  real y varía con el tipo de análisis genéticos
• VENTAJAS
• Técnica directa
• Alta reproducibilidad en cada paso del proceso
• altamente Preciso (si no siempre exacto)
• Los datos pueden ser objetivamente procesados
  digitalmente