Muta

1
Mutações
INSTABILIDADE DO GENOMA HUMANO REPARO
DO DNA
Genética Humana Profa. Dra.
Ana Elizabete Silva
2
ESTABILIDADE GENÉTICA
SOBREVIVÊNCIA E REPRODUÇÃO
REPLICAÇÃO PRECISA DO DNA REPARO DO DNA
Falhas
Aberrações cromossômicas mudança no genoma
Mutações no DNA doenças genéticas (câncer)
3
MUTAÇÃO qualquer mudança na sequência de
nucleotídeos ou arranjo do DNA
Células germinativas Mutação herdável
Células somáticas Mutação somática
4

• Mutações genômicas numéricas (aneuploidias)
• Mutações cromossômicas estruturais
• Mutações gênicas mutação de ponto

5
MUTAÇÕES LINHAGEM GERMINATIVA
OVOCITOGÊNESE ovócitos formados até 5o mês
número de divisões celulares do zigoto até oócito
fertilizado constante 24-31 divisões ? erro de
não-disjunção com aumento da idade (aneuploidias)

• ESPERMATOGÊNESE 30-31 divisões celulares até
  puberdade 5 div. p/espermatogênese (23
  ciclos/ano) centenas de divisões celulares
  dependendo da idade 30523x(25-13) 310
  divisões
• divisões celulares contínuas ? risco maior de
  erros de replicação do DNA ? 1/10 espermatozóide
  ? mutação deletéria nova
• Exemplos Neurofibromatose
• Acondroplasia
• Hemofilia B
• (avô materno fonte da mutação nova)

6
BASE MOLECULAR DAS MUTAÇÕES GÊNICAS
Mutações espontâneas
Mutações induzidas
7
MUTAÇÃO ESPONTÂNEA

• ausência de um tratamento com mutágeno fonte de
  variação genética
• Frequência baixa uma célula em 105 a 108
• Mecanismos
• erros na replicação do DNA
• lesões espontâneas depurinação, desaminação e
  danos oxidativos (radicais superóxido-O2
  peróxido de hidrogênio- H2O2 radicais
  hidroxila-OH)
• elementos genéticos de transposição

8
LESÕES ESPONTÂNEAS ERROS DE REPLICAÇÃO DO DNA

• PERDA DE BASES
• Depurinação 5.000 bases púricas (A e
  G)/dia/célula
• Desaminação 100 bases C gtU/dia/célula
• REPLICAÇÃO DNA pol 1 base errada na cadeia
  filha/10 milhões pb
• REVISÃO DE PROVA PROOFREADING corrige 99,9
  dos erros de replicação
• TAXA DE MUTAÇÃO (erros de replicação) muito
  baixa 10-10 por pb/divisão
• GENOMA DIPLÓIDE HUMANO 6x109 pb do DNA ? menos
  1 mutação de pb/divisão

9
PREVENÇÃO DE ERROS

• Alguns sistemas enzimáticos neutralizam compostos
  potencialmente danosos, antes que reajam com o
  DNA
• Exemplos desintoxicação de radicais superóxido
  produzidos durante os danos oxidativos
• a-  Enzima superóxido dismutase ? catalisa a
  conversão dos radicais superóxido ? peróxido de
  hidrogênio
• b-  Enzima catalase ? converte peróxido de
  hidrogênio em água

10
MUTAÇÕES INDUZIDAS

• Agentes químicos
• Análogos de bases 5-BrdU
• Alcilantes EMS
• Intercalantes acridina orange

• Agentes físicos
• Radiação UV
• Radiação ionizante raios X, gama

• Agentes biológicos
• Vírus ?mutação insercional

11
RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA

• Absorção da luz UV
• Estado excitado de uma
• base púrica ou pirimídica
• Ligação covalente entre
• duas pirimidinas adjacentes
• Anel ciclobutano
• dímeros de timina (TT)? mais estável
• dímeros menos estáveis CT, CC, TU e UU

12
(No Transcript)
13
TIPOS DE MUTAÇÕES DOENÇAS GENÉTICAS HUMANAS
1. Substituição de Bases Mutação de
Ponto Mutação de sentido trocado
(missense) Mutação sem sentido (nonsense) Mutação
de processamento de RNAdestroem sítios consenso
de corte cap, poliadenilação, criam sítios
crípticos códons finalizadores e mudança de
matriz de leitura (frameshift) Mutações
reguladoras afetam a ligação de fator de
transcrição e controle transcricional
14
TIPOS DE MUTAÇÕES DOENÇAS GENÉTICAS HUMANAS
2. Deleções/Inserções Adição/deleção pouco no.
bases Deleções maiores Distrofina Inserção L1 ou
Alu hemofilia A (L1) neurofibromatose
(Alu) Deleção/Duplicação (recombinação) Crossing-o
ver desigual Expansão trinucleotídeos
repetidos Repetição CAG D. Huntington Repetição
CGG S. do X frágil
15
POLIMORFISMO X MUTAÇÃO

• POLIMORFISMO variações no DNA
• ocorrência de dois ou mais alelos relativamente
  comuns para um único lócus.
• Variação do DNA na qual cada sequência possível
  está presente em pelo menos 1 da população.
• Ocorre comumente e está associado a um fenótipo
  normal.

16
Polimorfismo em sequência codificadora (5 DNA)
variante protéica ? fenótipos distintos

• Polimorfismos de proteínas
• Grupos sanguíneos ABO e RH
• Sistema de alfa1-antitripsina (?1-AT) doença
  pulmonar, vários alelos (frequência de 10-75)
• Proteínas de destoxificação de xenobióticos CYP,
  GST, NAT
• Proteínas de reparo do DNA XPD, XRCC1, XRCC2,
  XRCC3

17
Polimorfismo em sequência não-codificadora (95
DNA) intergênica ou dentro de íntrons ?
sem consequência para o funcionamento do gene
sem alterar proteínas
ESTIMATIVA DE BASES POLIMÓRFICAS 11000 pb
18
TIPOS DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS
Minissatélite VNTR
Microssatélite STR
19
APLICAÇÃO DE POLIMORFISMOS EM GENÉTICA MÉDICA

• Utilização como marcador genético análise de
  ligação
• Diagnóstico pré-natal de doenças genéticas
• Detecção de portador heterozigoto
• Avaliação de pessoas com risco de predisposição a
  doenças complexas câncer, doenças coronarianas e
  diabete
• Teste de paternidade e aplicações forenses
• Tipagem tissular para transplante de órgão

20

• Alelos 1 e 2 diferentes? polimorfismos alteram
  sítios de restrição
• Alelo 1 sítio R (cortado pela enzima restrição)
• Alelo 2 nucleotídeo X ? perda R (sem corte)
• Amplificação (PCR)
• primers que flanqueiam o sítio de restrição
• Digestão do produto de PCR com enzima R
• Eletroforese gel de agarose

RFLP Polimorfismos de Comprimento de Fragmentos
de Restrição
21
POLIMORFISMO DE COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA SIMPLES
(SSLP) - arranjos de sequências repetidas com
variação no comprimento devido diferentes números
de unidades repetidas (multi-alélicos).
MINISSATÉLITES (VNTR) Número Variável de
Repetições em Tandem -unidades repetidas de DNA
com 10-100 pb (30pb),

• MICROSSATÉLITES (STR) Repetições em Tandem
  Curtas
• unidades repetidas de 2-4 pb

22
MINISSATÉLITES (VNTR) unidades repetidas de DNA
com 10-100 pb (30pb), resultam de inserção em
tandem. Encontrados preferencialmente nas regiões
teloméricas (geralmente não transcritas) ? sítio
p/ recombinação homóloga.
Utilizados como marcadores polimórficos
datiloscopia de DNA (DNA fingerprinting)
http//www.fathom.com/course/21701758/session1.htm
l
23
Formação de unidades repetitivas
http//www.usask.ca/biology/rank/316/genomics/geno
mics.htm
24
Vítima de abuso sexual suspeitos 1 e 2
comparados com DNA do esperma encontrado na vítima
Família com filhos biológicos e adotivos Teste
de Paternidade Filha D2 o pai é de casamento
anterior Filho S2 adotado
http//www.scq.ubc.ca/?p250
25

• MICROSSATÉLITES (STR)
• unidades repetidas de 2-4 pb
• CACA...CA
• CAACAA...CAA
• AAATAAAT...AAAT.
• Existem 6,5x105 microssatélites no genoma
  humano.
• Lócus de microssatélite é multi-alélico cada
  pessoa deve ser heterozigota em mais de 70
• Espalhados por todo o genoma

Utilizados como marcadores polimórficos
datiloscopia de DNA
http//www.usask.ca/biology/rank/316/genomics/geno
mics.htm
26
Diagnóstico de Doença Genética
Doença Ligada ao X (recombinação0)
27

• POLIMORFISMO DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO SNP
• Mudanças de um único nucleotídeo distribuídas por
  todo o genoma.
• Aproximadamente 11350 pb no genoma
• Cerca de 1.42 milhões de SNPs no genoma
• Polimorfismos com dois alelos
• Aplicações marcadores de mapeamento genético
  antropologia molecular (evolução) e comparação
  entre diferentes populações (epidemiologia
  molecular)
• Detecção Chips de DNA (hibridização de
  nucleotídeos)

28
REPARO DO DNA
Reparar danos no DNA surgidos espontaneamente ou
induzidos por mutágenos

• Reparo de pareamento errôneo
• Reparo direto
• Reparo de excisão de bases
• Reparo de excisão de nucleotídeos
• Reparo de quebras de fita dupla no DNA

29
LESÕES RETARDAM PROGRESSÃO DO CICLO CELULAR
Reparo do DNA
Bloqueio do ciclo celular (Checkpoint)
Danos DNA
Apoptose
Identifica lesão no DNA
Proteína ATM
Sinal p/ p53 ? Ativar Genes Reparo DNA
30
REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO MISMATCH REPAIR -
MMR

• reparo pós-replicação bases incorporadas
  erroneamente no DNA durante a replicação (DNA
  pol 1 base errada na cadeia filha/10 milhões pb)
• REVISÃO DE PROVA PROOFREADING corrige 99,9
  dos erros de replicação
• eliminação de bases mal pareadas e alças de
  deleção/inserção

• atua na cadeia recém-sintetizada
• genes MSH, MLH e PMS

• Câncer de cólon não-poliposo familial
  instabilidade de microssatélites
• 70 a 85 de risco
• mutações em MLH1 e MLH2 são mais comuns

31
REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO
Reconhecimento do dano e corte na cadeia filha
32
REPARO DIRETO

• reversão ativa da lesão ? sem retirar a base
  danificada
• O6-metilguanina ? transição GC para AT
  (produzida endogenamente ou mutagênicos químicos)
• Enzima MGMT (metil guanina metiltransferase) ?
  remove o grupo metil
• alto custo energético ? uma molécula da enzima é
  inativada para cada lesão corrigida

33
REPARO DIRETO
34
REPAROS DE EXCISÃO
ETAPAS COMUNS etapa 1 incisão (endonuclease)
e excisão (exonuclease) etapa 2 ressíntese do
DNA (DNA polimerases ß, d, e) etapa 3 ligação
das extremidades (DNA ligases)
35
REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BER

• reparo de danos causados por agentes endógenos
  (hidrólises, oxigênio reativo) ? que modificam a
  estrutura das bases
• reparo de danos induzidos por radiação ionizante
  e agentes alcilantes
• realizado pelas DNA glicosilases ? quebram
  ligações base-açúcar ? liberando as bases e
  gerando sítios apurínicos ou apirimidínicos
  (sítios AP) ? reparado por endonucleases
  específica
• cada DNA glicosilase reconhece uma base alterada
  no DNA e catalisa sua remoção por hidrólise
• Etapas remoção da base danificada (DNA
  glicosilase) ? sítio AP ? incisão do sítio AP
  (endonuclease) ? excisão e remoção gerando lacuna
  ? síntese DNA (DNA polimerase) ? ligação da
  cadeia (DNA ligase)

36
REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BER
1 nucleotídeo
2-13 nucleotídeos
37
REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - NER

• remoção de adutos no DNA ? distorção da dupla
  hélice
• dímeros de pirimidina, HAP, cisplatina
• fatores ambientais
• principal mecanismo de reparo
• deficiência doenças genéticas
• realizado pelo complexo multienzimático XPA-XPG
• remove 24-32 nucleotídeos

38
(No Transcript)
39
Reparo por excisão de nucleotídeos (NER)
TFIIH complexo da RNA pol II com atividade de
helicase
XPG endonuclease que corta a fita em 3
ERCC1-XPF endonuclease que corta a fita em 5
DNA pol, PCNA, RPA e RFC síntese da fita
nova Ligase
40
REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA DUPLA

• DSB (quebra fita dupla) lesão espontânea
  induzida por radicais de O2 livres, replicação do
  DNA e agentes genotóxicos como a radiação
  ionizante
• causa de aberrações cromossômicas
• Reparo homólogo (RH) ? pareamento com o
  cromossomo homólogo intacto
• Reparo de ligação das extremidades não-
  homologa (NHEJ) ? religação direta das
  extremidades quebradas

41
REPARO HOMÓLOGO
Cromátides irmãs
42
Uma das fitas vermelhas apresenta uma quebra
DNA polimerase desloca a fita
d. Reparo posterior à duplicação por
recombinação semelhante à conversão gênica
ligação dos fragmentos
heteroduplex
duplicação posterior do DNA resulta em 3 alelos e
1 alelo
Resultado final um alelo verde foi convertido
em um vermelho
43
LIGAÇÃO DAS EXTREMIDADES NÃO-HOMÓLOGAS
44
http//www.sbbq.org.br/revista/mtdidaticos/Env.pdf
45
Xeroderma Pigmentoso Síndrome de
Cockaine Tricotiodistrofia Anemia de
Fanconi Ataxia telangiectasia Síndrome de Bloom
SÍNDROMES DE INSTABILIDADE CROMOSSÔMICA
?defeitos nos mecanismos de reparo e replicação
do DNA ? freqüência ? aberrações cromossômicas ?
incidência ? câncer
46
XERODERMA PIGMENTOSO (XP)
? AR ? Clínica manifestações cutâneas (1,5
anos) anomalias oculares (4 anos) anomalias
neurológicas (6 meses) ?Xeroderma (pele
seca) ?Incidência1/250.000 (USA) 1/40.000
(Japão) ?Células XP sensíveis a radiação UV
indivíduos incapazes
reparar dímeros TT risco ? câncer de pele
(2000x) XP defeito no reparo de excisão de
nucleotídeos (NER)
47
grupos de complementação XPA-XPG
diferenças clínicas defeitos enzimáticos
incapacidade de excisar danos induzidos pela
luz UV e mutagênicos químicos ? diagnóstico
exposição a luz solar ? tratamento
proteção da pele da luz
solar chapéus óculos que absorvem luz
UV bloqueadores solares roupas
protetoras acompanhamento periódico por
dermatologista
48
ANEMIA DE FANCONI (FA)
?AR ?Clínica anemia alterações da
pigmentação da pele (64) baixa estatura
(62) malformações do rádio (50) anomalias
oculares (41), renais (34), microcefalia
(37), deficiência mental (25) 90
anemia aplástica
49

• ? incidência 1/22.000 a 1/476.000 indivíduos
• 8 grupos de complementação FANCA a FANCG
  (heterogeneidade genética)
• células FA sensíveis à agentes químicos que
  causam ligações cruzadas entre as fitas de DNA
• -mitomicina C (MMC), diepoxibutano (DEB),
  mostarda nitrogenada (NM), cisplatina , ...
• freqüência ? de neoplasias leucemias e tumores
  hepáticos
• quebras cromossômicas espontâneas, figuras tri,
  quadri e multiradiais,

50
figuras radiais
endorreduplicação
51
SÍNDROME DE BLOOM (SB)
?AR ?Clínica ? peso ao nascimento retardo de
crescimento pré e pós-natal (145 cm H 130 cm
M) telangiectasias e fotossensibilidade
(borboleta) cabeça alongada, microcefalia,
inteligência normal imunodeficiência
infecções (respiratórias e gastrointestinais)
52

• Incidência 1/58.000 judeus
• asquenazim
• ? figuras quadrirradiais
• mutações no gene BLM 15q26.1
• DNA helicase ( RecQ)
• papel na replicação e reparo do DNA
• Risco maior de câncer carcinomas, leucemias e
  linfomas

53
ATAXIA TELANGIECTASIA (AT) SÍNDROME DE LOUIS-BAR
?AR ?Clínica -ataxia cerebelar (12-14
meses) disfunção neuromotora -telangiectasia
olhos e pele (3 e 5 anos) retardo de
crescimento (70)
incidência? neoplasias (linfoma e leucemia
linfóide) e imunodeficiências incidência
1/40.000 risco ? câncer de mama
heterozigotos AT
54
?células AT sensíveis a radiação ionizante e
agentes radiomiméticos (N-acetoxi-N-2-acetil-2-ami
nofluoreno - 4-NQO) ? linfócitos AT
rearranjos espontâneos dos cromossomos 7 e 14 ? 4
grupos de complementação A, C, D e E
mutações gene ATM ? gene ATM (11q22-23)
diversas vias controle transdução de
sinal checkpoint ciclo celular resposta celular
ao dano no DNA induzido por radiação ? gene ATM
interage p53 na checagem G1-S e mutações no gene
ATM abolem mecanismo de reparo pré-síntese de
DNA ? defeito mecanismo de reparo do DNA ou
defeito na replicação DNA