Genoma funcional: identificar genes diferencialmente expressos

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Genoma funcional identificar genes
diferencialmente expressos
Alguns fatos que afetam a eficiência dos métodos
em identificar esses genes

• 15 mil a 30 mil diferentes RNAs
• População de RNA em uma célula gt100 000 moléculas
  de RNA
• Classe RNA abundantes 1 dos genes 50 da pop.
  de RNAs
• Classe de RNA raros metade dos genes 1 pop.
  de RNAs

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Genoma funcional outras metodologias para
identificar genes diferencialmente expressos

• Limitações microarrays
• Genes pouco expressos não são detectados
• Difícil separação da contribuição de diferentes
  isoformas de um mesmo gene

Outros métodos

• Subtração de bibliotecas
• PCR supressivo
• mRNA fingerprint
• cDNA-AFLP
• CAP Trapper

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Genoma funcional outras metodologias para
identificar genes diferencialmente expressos
Subtração de bibliotecas de cDNA sistema
utilizando biotina, streptavidina e partículas
magnéticas
Tester biblioteca de cDNA aonde estão os genes
que quero fisgar meu gene (gene induzido
peloetileno tratamento com etileno)
Driver biblioteca de cDNA aonde não estão os
genes que quero fisgar meu gene (genes não
induzidos pelo etileno tratamento sem etileno)
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(No Transcript)
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Genoma funcional outras metodologias para
identificar genes diferencialmente expressos
PCR supressivo
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PCR supressivo
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PCR supressivo
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SUPRESSION PCR
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Differential RNA display
Reação de PCR com baixa temperatura de
anelamento, com nucleotídeos marcados radioativame
nte
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• Criticismos
• Pouca capacidade para detectar RNA raramente
  expressos
• Banda do gel mistura de cDNAs 50-75 bandas
  falsos positivos
• Artefatos primers curtos e baixa temp.
  anelamento amplificação inespecífica
• Limitada quantitividade competição pelos primers
  por transcritos de diferentes abundâncias
• Primers curtos semi-pareamento em outras regiões
  do mesmo genedif. Clones positivos
• podem ser o mesmo gene
• Fragmentos pequenos (150-400 bp) contendo
  principalmente região 3 UTR difícil identific.

• Modificações do método original
• Primers mais longos com programa com ciclo
  alterado
• Combinação com subtração
• Arbitrary primed PCR (RAP-PCR) dois primes
  curtos probl. Falsos positivos
• Integração do protocolo para PCR de longa
  distância no Differential display (até 2Kb-
  LDD-PCR)

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Introdução de um novo nucleotídeo Levou a
amplificação de um outro subgrupo de cDNAs
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Uso em larga escala do cDNA-AFLP

• Sinchronized tobacco cells ( 12 point into S and
  M?G1 transition were sampled.
• Exhaustive cDNA-AFLP 360 AFLP primer
  combinationsÇ 18,000 AFLP tags
• About 10 exhibited a modulated cell cycle
  profileÇ 1150 AFLP tags
• Tobacco BY2 cells were synchronised in the G1?S
  transition phase using
• Majority of these AFLP tags either match genes of
  unknown function or represent novel sequences.

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(No Transcript)
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