Diapositivo 1

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Journal Club um exemplo para começar
ruifonte_at_med.up.pt
Laboratório de Bioquímica da Faculdade de
Medicina do Porto
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Este paper é um marco histórico na medicina e na
bioquímica.
Cori, G. T. Cori, C. F. (1952)
Glucose-6-phosphatase of the liver in glycogen
storage disease, J Biol Chem. 199, 661-7.
Foi a primeira vez que se conseguiu provar uma
hipótese que havia sido formulada no início do
século XX que algumas doenças congénitas
poderiam ter como causa o deficit de uma
enzima. O trabalho foi feito por dois
investigadores que tinham ganho o prémio Nobel da
medicina em 1947.
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Em 1952, já se conhecia a via de degradação do
glicogénio. A via de síntese só foi descoberta no
final dessa década (por Luis Leloir em 1959).
Glicose-6-fosfátase
Fosforílase do glicogénio
fosfoglicomútase
H2O
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Alguns doentes tinham acumulação de glicogénio no
fígado e episódios de hipoglicemia e porque em
1929 von Gierke tinha descrito os achados
morfológicos em doentes com estas características
a doença (de facto um síndrome a que correspondem
várias doenças) tinha sido designada de doença
de von Gierke. Com base no que se conhecia sobre
o metabolismo do glicogénio, Cori e Cori
formularam hipóteses acerca da patogenia da
doença de von Gierke e testaram essas hipóteses.
De acordo com o que se conhecia na época que
hipóteses seriam plausíveis?
Será que o defeito está na glicose-6-fosfátase?
Como testar esta hipótese?
1- Colheram amostras de fígado em indivíduos
normais, em doentes com patologias hepáticas não
relacionadas e com doença de von Gierke. 2-
Prepararam homogeneizados de fígado a partir
dessas amostras. 3- Mediram a actividade da
enzima suspeita nesses homogeneizados. 4-
Compararam os resultados obtidos com as
diferentes amostras. 5- Procuraram interpretar os
resultados. 6- Formularam novas hipóteses com
base nesses resultados e testaram-nas.
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Método geral usado para medir a
glicose-6-fosfátase. A actividade da enzima foi
calculada subtraindo os valores de Pi formado em
ensaios gémeos que não incluíam o substrato.
Biopsia hepática
Homogeneizado de fígado
G6P
Reagente que desnatura a enzima e reage com o
Pipermitindo o seu doseamento
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Meio de ensaio Volume 1 mLTampão citrato 30
mM, pH 6.8Homogeneizado hepático equivalente a 4
a 33 mg de fígado.Substrato glicose-6-fosfato
5 mMTemperatura 30ºCTempo de ensaio 1
horaPararam a reacção com ácido tricloroacético,
filtraram e dosearam a Pi formado.Expressaram os
resultados em Pi formado por 100 mg de fígado.
Que doentes tinham, claramente valores muito
baixos de glicose-6-fosfátase?
A análise do glicogénio de CH mostrou que era
anormal demasiado ramificado. Porque é que o
resultado de CH era algo mais baixo que o normal?
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Perguntas?
1- Dando-se a coincidência de 2 dos 3 resultados
com valores muito baixos corresponderem a
material de autópsia poderia isto querer dizer
que a glicose-6-fosfátase sofreu degradação após
a morte dos pacientes MAS e PS? Os dados
pareciam negar esta hipóteseque dados?
2- Será que o fígado de MAS continha um inibidor
que impedia a acção catalítica da
glicose-6-fosfátase? Testaram e os dados obtidos
também pareciam negar esta hipótese. Que dados?
3- Será a glicose-6-fosfátase era normal mas
faltava uma substância não enzímica no fígado de
MAS e PS que era essencial à actividade da
enzima? Ferveram fígado de CS e os dados
obtidos também pareciam negar esta hipótese. Que
dados?
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4- Será que o deficit poderia ser na
fosfoglicomútase (e não na glicose-6-fosfátase) ?
Para isso substituíram a glicose-6-P por
glicose-1-P no meio de ensaio voltaram a testar
a formação de Pi. No caso MAS baixo Pi formado
nos dois ensaios, acumulação de glicose-6-P
quando se usou glicose-1-P como substrato. No
caso CS (controlo) alta produção de Pi nos dois
ensaios e não ocorreu acumulação de glicose-6-P
quando se usou glicose-1-P como substrato.Serão
estes dados compatíveis com deficit de
fosfoglicomútase?
5- Também se testaram as actividades de duas
enzimas conhecidas como fosfátase ácida e
alcalina. Usaram como substrato glicerofosfato e
pH 5 no primeiro caso e pH 9 no segundo.
  pH 5 pH 9
CS (controlo sem doença) 135 48
CH (deficit de enzima desramificante ?) 127 17
PS (deficit de glicose-6-fosfátase) 122 39
Serão estes dados compatíveis com deficit de
fosfátase ácida ou com deficit de fosfátase
alcalina?