O????????? ?????????????????? ?? ????????? ?? ???????? ??????? ??????????? ???? G, ?, C, ?, ? ?????????? ????????? ?? ???.

1
??????????? ?? ???

• ?????? ???????, ??????
• ?????? ??????, ????????
• ??????? ??????, ????????
• ?????? ?? ????????? ????????
• ?????????? ??????????? - ?????

2
??????????? ?? ???

• O????????? ?????????????????? ?? ????????? ??
  ???????? ??????? ??????????? ???? G, ?, C, ?, ?
  ?????????? ????????? ?? ???.

• ??????????? ?????? ?? ???-?????????? ???????????
  MS2 (Fiers et al 1976)
• ??????????? ?????? ?? ???? ?174 (5kb) ??
  ????/????? ?????? (Snager Coulson, 1977)
• ????? ????? ?? ??????????? ?? ??? ???????????
  ???? ??????? ?????????, 500 ??? (Maxam
  Gilbert, 1977)
• ??????????? ???? ??????? ??????????? ?? ???????
  ?? ???, (Sanger et al, 1977)

3

• Thermal cycle sequencing
• ??????????? ??????????? - ??????? ??????????? ?
  ?????????????-???????? ???????????????????
  (Dye-terminator sequencing)
• - ????????? ?????????????
• - ??????? ???????? ?? ???????.

• HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING
• Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS)
• Polony sequencing (e????????? PCR)
• Pyrosequencing
• Solexa sequencing (bridge PCR, reversible dye
  terminator)
• Sequencing by ligation (SOLiD)
• Ion-semiconductor sequencing
• Nanoball sequencing
• Single-molecular sequencing (Helioscope)
• Single-molecule Real-Time sequencing
• Nanopore
• VisiGen (FRET, ?????????? ? ????????????? ????? ?
  ??)
• ??????????? ???? ???????????? (Microarray)

4
????? ?? ??xam-Gilbert

• Allan Maxam Walter Gilbert, 1977?.
• Gilbert, Sanger, Berg, ???????? ???????, 1980,
  ??

• ??????? ??? ???????????? ?? ???????? ????????? ?
  ?? ???????? ???????????, ???? ???????
  ???????????? ?? ?????? ? ???-?????????? ?
  ?????????? ??????-?????????? ?????????, ??? ?? ?
  ?????????? ????????????? ?????????

5
??????????? ?? Sanger
Frederick Sanger, 1974, ???????? ???????,
1980 ??????????? ???? ???????? ??????????? ??
???????, ? ????????????-???????? ??????

• ???, ???????, ?????, ????
• ?????
• 5- ????????? ? 32?
• ?7 ???-??????????, topt (37?)
• ?????? ??????? ???????
• ????? ???? - ? ??????? ?????????

6
THERMAL CYCLE SEQUENCING ( Sears et al., 1992)

• ????????? ?? ????????????? ???-?????????? ? PCR
• ??????? ???????? dsDNA ? ????? ??-?????
  ?????????? ??????? (?? ? ?????????? ?????????????
  ????????? ?? ?????????).
• ???????? ? ???? PCR, ?? ???? ? ???? ??????? ?
  ????? ?????????? ???? ??????? ?? ???? ??????????
  ddNTP. ?? ??????? ?? PCR, ???????????? ??
  ???????? ? ???????, ? ?? ??????????????, ??? ????
  ?? ?????? ???? ?????? ??????.

????? ??? ??????????? ????? ?? Sanger, ?????????
?? ddNTP ? ???????????? ???? ???? ?? ???????
???????????. ?????????? ?????? ? ????????
???????, ?? ???????? ???????????????? ? ????? ??
?? ????????.
7
??????????? ??????????? (Leroy Hood and
colleagues,1986)
????? ?? ??????????? ?? ???, ??? ?????
????????????-?????????? ?????????? ? ??????????
?????????, ?? ???????? ? ????????????? ?????????,
???????-?????????? ???????? ?? ??????? ?
??????????????? ?????? ?? ???????????. ??????????
?? ?????????????-???????? ????????. ????????? ??
4 ??????? ??????? ?? ???? ?? ????? ?????, ???
?????, ?? ????? ????????? ? ??????? ? ????????
??????????. ??????????????? ????????? ?????
???????? ????????????? ????????? ?? ??????????? ?
??????? ?? ?????????? ????????. ??????????? ??
????????????? ??????????? ? ?????????????-????????
????? ??????? ???????? ??????????? ?? ??????
??????????? ??? ???????????.
8
??????????? ???????????

• ??????????
• ??? labeling step
• Thermal cycle sequencing
• PCR - ??????
• ????????, ????????????? ? ????????? ????????
• ???????? ??????????? ???????? ??????????
  ?????????, ?????? ???????????? ??? ??????????,
  ???????, ??????????
• ???? ???????? ?? ??????????? ?? ss ? dsDNA
• ?????????? ?? ??????????? ?? ?????? ???????
  (BAC)

9
??????????? ??????????? ? ?????????????-????????
??????
?1. ????????? ?? ???????? ????? ?? ????????? ?
???? ?????????, ???? ????? ????? ? ??????? ?
???????? ?????????. ?2. ??? ????????????? ?? ?
????, ????? ???????? ????????? ???? ????????,
????? ???????????? ???????????? ?????, ??????????
? ?????????? ???????? ?? ??????? ??
??????????. ?3. ???????????? ?? ??????? ??
??????????? ? ??????????? ???? ????? ?? ?????? ?
???????? ???? GATC ? ???????.
10
Rhodamine DyeTerminators
??????? ??????????? ? ?????????????-????????
??????
Rhodamine
Fluorescein
DNA-Rhodamine-Fluorescein
11
??????????? ?????????? ???3130?l
12
???????? ????????????????

• ????? ?? ?????????
• ??????? ?? ?????????
• ??????????? ?? ???????
• ???? ?????
• ?????????? ?? ???????

13
??????????? De novo

• ??????
• Shot-gun
• Primer walking
• ???????? ?????????? ? ???????????
• Nested - ???????
• ??????????? ?? ????
• PCR-????????????

14
RESEQUENCING

• PCR ????????
• ???????? ? ?????? ?? ???????????
• Nested (????????) ????????

???????????
MLST (Multi Locus Sequence Typing)
15
?????? ?? ??????????? ???

• ??????? ?? ???
• ?260/A280 1.7 - 2.0
• lt 1.7 ????????? ??????/?????
• gt 2.0 ????????? ???
• ?230/A260 0.3 0.9
• gt 0.9 ????????? ??????

16
?????? ?? ??????????? ??

• ABSOLUTE QUANTITATION
• ??????? ?????? ?????????? ?? ??????????????? ??
  ???
• ??????? ????????? ?? ?????????? ????? ? ???????
  ?? ??????? ??? ? ???????? ????????????,
  ????????????? ???????? ???????????????????
• TaqMan ?????? ???????????? ????? ?????????
• SYBRGreen ?????? (MGB) ??-????? ??????????
• ????????? ?? ??????? ? ????? dsDNA

?????????????? ?????? ????????????? ??? Hoechst
33258 ????? ???????? ??? ??? ??????? ??
?????????????? ??? ??-???????? ??????? ??????
??????? ???, ??????? ?? ??? ?? ? ??
???????? ????????? ????? ????? ??????????
??? ?????? ??????? ??? ??? ? ??????
GC-?????????? PicoGreen ????????? ?????????? lt
25 pg/ml, ?? 100 ng/ml
17
?????? ?? PCR-????????
18
PCR ?? ????????????????? ???????????? ?
??????????????
??????????? master-mix

• ?????? ?? ????????
• ???????????? ?? MgCl2
• ???????????? ?? dNTP
• ????????? ????????????
• ???????????? ?? ???
• ????????? ?? PCR
• ????? Taq-?????????? hot-start - ?????

19
PCR - ???????

• ????????? 600 ?.??., 40 ???. ?????
  ????????????
• ???????????? ?? ????????-?????????
  ?????????????????
• Taq-?????????? ? proofreading-????????? (lt 10
  k?)
• - ?? ???????????? ?? ?????????????? ???????
• ???????????? ?? GC-?????? ????????
• Hot-start ?????????? ?? ???-????????, ?????????
  GC gt 65
• ? ????????? ???????? ?? ?????????? ??
  ??????????????.
• ??????????? ?? ????? ???????? (long range)
• lt 15 k? - Hot-start Proofreading (????????
  3-5????????????? ?????????), ?????? ??????? ???
  ????????? ? ??????????
• lt 20 k? ???????? ???????? Hot-start ?????????
  ???????? ?? ?????????? ?? ???????????????

20
?????????? ? ???????? ?????-????????? ??
???????????

• ??????? ?? ????????, ??????????, ??????? ???
• ????????? ?????? ?? ??????????
• ????? ????? ?? ???????????
• ???????????? ??????? ??? ??????? ?? ?????????
  ???????
• ????????? ?? ?????? ????????
• ????????? ?????? ?? ??????????
• ???? ???????? ?? ???????
• ??????? ?? ???? ? ????-????????? ??????
• ?????????? ?? ??????????????
• ????????? ???-????????????? ?????????
• ???? ???????? ?? ???????

21
??????????? ?? PCR-?????????????????? ??
???????? ?? ???????????? ??????????
???????? ?????????? ???????????
???? ??????????? ????/?????
???? ???????? ???????????
???????????? PCR-???????? ????????? ? ???????????
?????? ?? ???????????

• ???????

• ??????????

• ???????

• ???-??????????

E??????????? I (???I) - ?????????
??????????? ??? (????????) ??????? ?????????
(SAP/CIP) -????????????? ????
PCR-???????/ ????. ???? (1/5 ??? 1/10)

• ???-?????????
• ??????????????

22
????? ?? ????? ?? ????????????????? ??
?????????? ?? PCR-????????
????? ??????????? ?????????? ???????????
??????? ??? ??????? ???? ?? 1 ?????????? PCR-??????? ???? ? ????? ????? ????? ?????????? ?? ????????????? ?????? ??????????? ??? ?????????? ?? ?????????? ?? ???????? ?????????????? PCR-???????? ? ???????-????????
?????????? 1 PCR-??????? PCR ? ???????? 0.2µm ? ???? 100 µm ???? ? ????? ????? ????? ?????????? ?? ????????????? ?????? ??????????? ??? ?????????? ?? ?????????? ??????? ??????????? ?? ???????? ?????????????? PCR-???????? ? ???????-????????
?????-????????? ????????? ???????? lt100?.??. (???????-??????) ???? ? ????? ????????????? ???-????????? ?? ?????????? ?? ???? ??????????? ???? ?? ???????? ?????????????? PCR-????. gt100?.??.
???-?????????? ?? ?????? ?? ?????????? ?? PCR-???????? ?????????? ?????????????? PCR-???????? ? ???????-???????? ? ????????? ???????? ????? ????? ??????? ????? ?? (??????? ???)
23
????? ?? ???????????? ????????
24
THERMAL CYCLE SEQUENCING

• ???-???????
• ???????
• BigDyeTerminator
• ?????
• AmpliTaqDNA Pol FS
• ????? ????????????? ????? ???? ? ?????
• ????? ???????? 5-3-e???????????? ?????????
• ?????????? ? ????????????? ???????????
  ?????????????.

25
BigDyeTerminator Sequence Kits
???????????? ??? ????????
BigDyeTerminator v3.1 ???????????, de novo, ??- ??????????? ??????????? ?? ????? ???????, ????? ??????? ??????? dITP ?????? dGTP ?? ?????????? ??????????? ?? ????????
BigDyeTerminator v1.1 ????????? ????????? ? ??????? ?? ???????? ??????????? ?? ???? PCR-???????? ??????????? ?? ????? ??????? ? ????? ??????? ??????? dITP ?????? dGTP
dGTP BigDyeTerminator ??????? dGTP ??????????? ?? G-?????? ??????
dRhodamine Terminator ??????????? ?? ????????????? ???????? ? ?-?????? ??????? dITP ?????? dGTP
BigDye Primer ??????????? ?? ssDNA ? dsDNS ? PCR-??????? ???????? ?????? ? ??????? ???????? ????????? ?????? ? ??????? ?? ????????
26
??????????? ?? GT-????? ????? ? BigDyeTerminator
v3.1/1.1
??????????? ?? GT-????? ????? ?
dGTPBigDyeTerminator v1.0/3.0
??????????? ?? 2 ????????????? ?-???????? ?
dRhodamineTerminator
27
??????????? ?? ????????????? ???????
??????????? ?????????? ? ????????????? ????????
?????????? ?? ????????? ??????????????
?????????????????? ??????????? ?? ???????,
?????????????????? ????????? ? ??????? ?? ?????.
28
EDTA/CH3OONa/???????? ????????????

• ??????????? ?? ????????????? ??????? ? ?????????
  ??????
• EDTA ??????????? ?????????????
• ??????? ?????? ??????? ?????? ????????????
  ????????

??????????? ????? ????????? ?????????? ? ??????
?? ????? ???? ?? ?????? ?? ????????
????? ? ????? ????????????? ?????? ? ??????
???????
???????? ?? ??? ?????? ??????????? ?????????
?????? 96 ???????? ?? ?????? ?????????
?????? 3 ? ??????? ?????? (pH 4.8) ????????????
?? ?????????? ???????? ???? ??????????
??????????????
29
???-?????????

• ?????? Sephadex G-50
• ??????? ????? ????????? ????
• ?????????????? ??????? ?? ?????? ? ??????? ??
  ????????
• ??????? LMW-???????? ? ???????? HMW-????????

??????????? ???? ???????????? ????????? ? SDS ?
????????? (BD?v3.1)
????? ????????????? ??????? ?? ?????????????
??????????????
???????????? ?? ?????????????? ???? ?????????? ??
????????????? ??????? ???? ????? ???????? ?
?????? ?? ?????? 0.1 10 µm
30
??????????? ? ???????? ???????

• ?????????? ????????????? ? ???????? ?????????
• ???????? ???????, ? ???????????? ??????
  (????????, ?ligo (dT), ???????????? ? ??.), ?
  ???????? ??? ??
• ???????? ??????? ?????????????? ???????, ?
  ?????, ???????? ? ???? ??????? ? ????????

??????
?????????? ?????????
31
?????????? ?? ??????? ?? ???????????
32
?????????? ?? ??????????????????????
ABI3730xl???????????? ????????????????
???????????????? ?? ???????????????????????
?? ???????????????????????????????????Data
Collection software????????? ?? ???? ? ?????????
??????????????? ?? ????? ? ?????????????? ??
????????Instrument protocolAnalysis
protocol????????? ?? ??????? ?
????????????????? ?? ???????????
33
?????? ?? ???????