Cosa sono i microrganismi?

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Cosa sono i microrganismi?
Le prime forme di vita comparse nel pianeta
Forme di vita unicellulari
Autonome, in grado di metabolizzare,
riprodursi differenziarsi, comunicare, evolvere
Dotate di piccole dimensioni
Visibili solo al microscopio
2
Classificazione

alghe
Protisti superiori (eucarioti)
protozoi
miceti
Regno dei protisti

Protisti inferiori (procarioti)
batteri
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Differenze tra procarioti e eucarioti
Caratteristiche Procarioti Eucarioti Dimensioni
0,3-2µm gt 5µm Organizzazione genetica Nucleo
circondato da membrana Assente Presente DNA
complessato agli istoni Assente Presente Numero
di cromosomi Uno Più di uno DNA
extracromosomiale
Plasmidi Mitocondriale Geni Contigui o
riuniti in operoni Discontinui Divisione per
mitosi
Assente Presente Citoplasma Reticolo
endoplasmico Assente Presente Apparato del
Golgi Assente Presente Mitocondri Assenti
Presenti Lisosomi Assenti Presenti Ribosomi
70 S 80 S Membrana citoplasmatica Assenza di
steroli Presenza di steroli Parete
cellulare Formata Se presente, da
peptodoglicano formata da polisaccaridi

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Forma dei batteri

• La forma è una condizione
• Fissa
• Geneticamente determinata
• Conferita dalla parete cellulare

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Forma dei batteri
Cocchi forma rotondeggiante
6
Forma dei batteri
Bacilli forma a bastoncello
7
Forma dei batteri
Spirilli forma a spirale
8
Forma dei batteri
Vibrioni forma a virgola
9
Disposizione dei batteri

• Indica il modo con il quale le cellule,
  riproducendosi, si dispongono nello spazio
  mantenendo o meno uno stretto rapporto di
  continuità.
• E condizionata dal modo in cui si susseguono
  nello spazio i diversi piani di divisione
  cellulare in successive generazioni

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Disposizioni più frequenti
Diplococchi (cocchi uniti a coppie)
Streptococchi (cocchi uniti a catenelle)
Cocchi
Stafilococchi (cocchi uniti in ammassi irregolari)
Tetradi (cocchi uniti in gruppi di quattro)
Sarcine (cocchi uniti in gruppi di otto, forma
cubica)
Diplobacilli (bastoncelli uniti a coppie)
Bacilli
Streptobacilli (bastoncelli uniti a catenelle)
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Disposizioni più frequenti (alcuni esempi)
Cocchi
Bacilli
Diplobacilli (bastoncelli uniti a coppie)
Streptobacilli (bastoncelli uniti a catenelle)
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Colorazione di Gram

• Colorazione più importante e usata in
  batteriologia.
• Prende il nome dal patologo danese che la mise a
  punto.
• Permette di distinguere i batteri in Gram e
  Gram-.
• Colorazione differenziale.
• Utilizzando differenti coloranti in tempi
  successivi, individua differenze strutturali
  della cellula batterica.
• Le differenze strutturali riguardano la parete
  cellulare.
• I batteri Gram si colorano in viola.
• I batteri Gram- si colorano in rosso.

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Colorazione di Gram (esecuzione)

• Si allestisce il preparato
• Si versa sul preparato una soluzione di
  cristalvioletto
• Si allontana il colorante e si versa sul vetrino
  un mordenzante il liquido di Lugol (i
  mordenzanti sono sostanze che formano un composto
  insolubile con il colorante facilitandone
  lunione col substrato)
• Si tratta il vetrino con una soluzione
  decolorante formata da alcool e acetone
• Si applica un colorante di contrasto la fuxina
  (rossa)
• I batteri Gram trattengono il primo colorante
  risultando colorati in violetto, i batteri Gram-
  si decolorano assumendo la colorazione rossa di
  contrasto

14
Colorazione di Gram (esecuzione)
15
Colorazione di Gram (esempi)
16
A cosa è dovuto il diverso comportamento dei
batteri nella colorazione di Gram?

• E dovuto ad una diversa permeabilità degli
  involucri cellulari che è maggiore (tale da
  consentire lasportazione del complesso
  cristalvioletto-liquido di lugol da parte del
  decolorante) nei batteri Gram negativi e minore
  nei Gram positivi che in tal modo trattengono il
  primo colorante.
• La Gram positività e la Gram negatività, dovuta
  alla differente architettura molecolare della
  parete, è espressione di una dicotomia evolutiva
  dal profondo significato clinico.

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Struttura della cellula procariotica
Il carattere citologico più importante è
rappresentato dalle piccole dimensioni e
dallassenza di compartimenti intracellulari
separati da membrane.
Caratteristica è la struttura cromosomica,
estremamente semplice, immersa direttamente
(senza interposizione di membrana nucleare) nel
citoplasma.
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Cromosoma batterico (sostanza nucleare)

• Si trova allinterno del citoplasma.
• Appare come un materiale filamentoso, costituito
  da DNA immerso nel citoplasma non separato da
  alcuna membrana.
• Viene considerato lequivalente di un cromosoma
  (cromosoma batterico o cromonema).
• E fortemente raggomitolato la sua lunghezza, se
  disteso, supera di 1000 volte la lunghezza della
  cellula.
• E privo di estremi liberi, presenta struttura
  circolare con implicazioni sulla duplicazione
  cellulare e sulla genetica batterica.
• Non è legato ad istoni ma è complessato a
  proteine acide dalle quali è facilmente
  dissociabile.
• E collegato alla membrana in corrispondenza di
  zone caratteristiche che rappresentano lorigine
  della duplicazione durante la riproduzione
  cellulare.

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Duplicazione del DNA
Il cromosoma batterico prende contatto con zone
particolari della membrana che rappresentano
lorigine della duplicazione. Il processo
continua da entrambi i lati e termina al punto
opposto rispetto allorigine. Contemporaneamente
al distacco delle emieliche si ha la formazione
del filamento complementare. Terminato il
processo si formeranno due nuovi filamenti di
DNA ciascuno dei quali sarà formato da unelica
parentale e dal filamento complementare,
assicurando la esatta ripartizione del corredo
genetico
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Plasmidi definizione
Sono elementi genetici extracromosomiali a
struttura circolare, presenti nel citoplasma
batterico, di dimensioni minori rispetto al
cromosoma, dotati di relativa autonomia
replicativa e in grado di condizionare caratteri
fenotipici importanti sotto il profilo
dellazione patogena, della resistenza agli
antinfettivi e della sopravvivenza
nellambiente.
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Grandezza e numero dei plasmidi

• La grandezza dei plasmidi si misura in kilobasi
  (lunghezza media di un gene).
• Esistono plasmidi più piccoli di poche kb e
  plasmidi più grandi con più di 1000 kilobasi.
• I plasmidi più grandi sono presenti in ununica
  copia.
• I più piccoli possono essere presenti in più
  copie.
• Tutti i plasmidi possiedono una serie di geni che
  codificano gli elementi necessari e sufficienti
  alla loro duplicazione e ripartizione tra le
  cellule figlie al momento della divisione
  cellulare.

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Trasferimento intercellulare dei plasmidi

• I plasmidi oltre a venir trasmessi verticalmente
  da cellula madre a cellula figlia, possono
  trasferirsi orizzontalmente tra cellule diverse.
• Esistono plasmidi autotrasmissibili e non
  autotrasmissibili.
• I plasmidi autotrasmissibili possono trasferirsi
  grazie al contatto cellula-cellula e sono detti
  coniugativi. La trasmissione mediante
  coniugazione viene controllata da geni tra.
• I plasmidi non autotrasmissibili non contengono
  geni tra, il loro trasferimento per coniugazione
  è reso possibile dalla presenza di plasmidi
  coniugativi che coabitano nella stessa cellula.

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Funzioni dei Plasmidi
Le funzioni dei plasmidi sono numerose anche se
non indispensabili sono utili a garantire la
sopravvivenza dei batteri in particolari
situazioni o habitat
metaboliche
Utilizzazione di sostanze,produzione di pigmenti
etc.
resistenza
Agli antibiotici, agli ioni, ai raggi U.V.
virulenza
Produzione di esotossine, batteriocine, polimeri
adesinici
Modificazione e restrizione di DNA estraneo
biologiche
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Tipi di plasmidi
Plasmide F è un plasmide coniugativo, contiene
geni tra che promuovono il trasferimento del
plasmide stesso da una cellula donatrice ad una
cellula ricevente. Può integrarsi nel cromosoma
batterico rendendo possibile la mobilizzazione
intercellulare di geni cromosomici.
Plasmide R è un plasmide autotrasmissibile capace
di codificare per la produzione di enzimi in
grado di conferire resistenza nei confronti di
diversi farmaci antibatterici e di operare il
trasferimento interspecifico di tali resistenze.

• Plasmidi batteriocinogeni codificano per la
  produzione di batteriocine
• cioè di proteine tossiche in grado di uccidere
  batteri della stessa
• specie, ma innocue per le specie che le
  producono. Tali sostanze
• vengono espresse di prevalenza quando sia
  necessario ristabilire un
• alterato equilibrio in particolari nicchie
  ecologiche.

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Citoplasma

• Il citoplasma batterico è estremamente semplice,
  privo
• di molti elementi morfologici che caratterizzano
  il
• citoplasma delle cellule eucariotiche quali
• reticolo endoplasmico
• apparato del Golgi
• mitocondri
• lisosomi
• vacuoli

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Citoplasma composizione

• H2O
• Componenti inorganici sodio, magnesio, calcio,
  ferro etc
• Macromolecole organiche
• Polimeri

Le sostanze organiche contribuiscono maggiormente
a generare una elevata pressione osmotica che
contraddistingue linterno della cellula. Tale
pressione è maggiore nei Gram e minore nei Gram-
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Inclusioni citoplasmatiche
Occasionalmente nel citoplasma sono presenti
granulazioni (inclusioni) citoplasmatiche, di
diversa composizione aventi il significato di
accumuli di materiale di riserva.

• Glicogeno

• Acido ß-idrossi-butirrico

Sono costituiti da

• Polisaccaridi

• Polifosfati

I granuli di polifosfati sono detti
metacromatici presentano il fenomeno della
metacromasia si colorano diversamente rispetto al
colore utilizzato. Sono particolarmente
abbondanti in Corynebacterium diphteriae
costituendone un carattere distintivo importante
utile per lidentificazione.
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Ribosomi
Rappresentano lo strumento universale delle
sintesi proteiche per qualunque tipo di
organizzazione cellulare procariotica o
eucariotica. I ribosomi procariotici, tuttavia,
presentano differenze fondamentali rispetto agli
eucarioti
Caratteristiche

• Sono presenti nel citoplasma in numero elevato
  (fino a 15000)

• Funzionalmente identici ma strutturalmente
  differenti rispetto ai procarioti

• Le differenze indirizzano lazione
  selettivamente tossica di alcuni antibiotici

• Hanno un coefficiente di sedimentazione 70S
  (80S per gli eucarioti)

• Sono costituiti da due subunità una più grande
  50S e una più piccola 30S

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Ribosomi
Forma
Complessivamente globulare, la subunità più
piccola alloggia in una cavità presente nella
subunità più grande
Composizione
60 RNA 40 proteine Una unità ribosomiale
completa contiene 55 proteine e tre tipi di
RNA 5S, 16S, 23S
Organizzazione strutturale
La subunità più grande contiene 34 proteine(1L,
2L etc.) e due RNA (5S, 23S) La subunità più
piccola contiene 21 proteine (1S, 2S etc. e un
RNA (16S)
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Membrana citoplasmatica

• Delimita esternamente il citoplasma
• Si trova al di sotto della parete cellulare
• E strutturalmente simile ma funzionalmente
  differente rispetto alla membrana degli eucarioti

Composizione chimica
Proteine 60 Lipidi 40 Carboidrati
tracce
Proteine

• Integrali sono situate nello spessore della
  membrana

• Periferiche sono situate superficialmente

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Lipidi
assenza di steroli, presenza di fosfolipidi
quali

• Fosfatidil-glicerolo

• Difosfatidil-glicerolo

• Fosfatidil-etanolamina

• Fosfatidil-serina

• Fosfatidil-inositolo

Acidi grassi

• Assenza di acidi grassi polinsaturi

• Presenza di acidi grassi ramificati e derivati
  dal ciclopropano

Glicerolo

• Esterificato con aminoacidi quali lisina,
  alanina, glicina, ornitina

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Carboidrati
Legati ai lipidi (glicolipidi)
Legati a proteine (glicoproteine
Struttura
Modello a mosaico fluido
I fosfolipidi formano un doppio strato continuo,
con le parti apolari rivolte verso linterno
(porzione idrofobica) e le parti polari rivolte
verso la porzione esterna idrofila.
33
Funzioni della membrana citoplasmatica

• Delimita esternamente il citoplasma
• opera il contenimento degli organi interni della
  cellula
• presiede agli scambi
• rende possibile il trasporto attraverso la
  cellula tramite meccanismi attivi (contro il
  gradiente di pressione osmotica), passivi (leggi
  dellosmosi), facilitati (carriers)
• partecipa al processo di riproduzione cellulare
  (duplicazione DNA, formazione del setto interno
  di divisione)
• rende possibili i processi di respirazione
  cellulare in assenza dei mitocondri
• promuove la formazione del setto di divisione
  asimmetrica nella sporulazione
• partecipa alle fasi intermedie e finali del
  processo di biosintesi del peptidoglicano
  (componente fondamentale della parete cellulare)
• promuove il rilascio di enzimi implicati nella
  resistenza batterica agli antibiotici.

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Mesosomi
Nelle sezioni ultrasottili esaminate al m.e. la
membrana citoplasmatica presenta delle
invaginazioni che si approfondano nel citoplasma
e possono assumere una struttura complessa ricca
di microtubuli e microfilamenti. A queste
strutture più frequenti e complesse nei Gram,
denominate mesosomi sono state attribuite
diverse funzioni in rapporto alla divisione
cellulare, alla secrezione di esoenzimi e ai
processi di fosforilazione ossidativa. In realtà
i mesosomi sono risultati essere degli artefatti
dei processi di fissazione. Il fatto che essi
tendano a formarsi in zone precise della
membrana suggerisce che la membrana stessa possa
presentare regioni con particolari
specializzazioni strutturali e funzionali
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Parete cellulare
Caratteristiche

• Struttura più importante e caratteristica dei
  batteri

• Delimita esternamente la cellula batterica, al
  di fuori della membrana
• citoplasmatica

• Struttura fondamentale per garantire lintegrità
  cellulare

• Posseduta universalmente da tutti i batteri ad
  eccezione del genere
• Mycoplasma (assenza di parete) e del genere
  Chlamidia (parete di
• diversa composizione)

• Struttura esclusiva dei batteri, non ha
  corrispondenza negli eucarioti
• i miceti hanno parete cellulare, ma costituita
  da polisaccaridi e proteine

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Parete cellulare
Funzioni e proprietà

• Assicura protezione alla cellula nei confronti
  degli agenti esterni e della lisi
• osmotica

• Definisce la differente forma ai batteri con la
  sua struttura rigida e compatta

• Fornisce un bersaglio allazione selettivamente
  tossica di alcuni antibiotici
• che vanno ad interferire a vario livello nel
  processo di biosintesi del principale
• componente della parete

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Parete cellulare
Struttura
Il componente fondamentale della parete è un
polimero il peptidoglicano formato da due
aminozuccheri alternati tra loro e uniti da un
legame ß-glucosidico rappresentati da

• N-acetilglucosamina
• N-acetilmuramico

Ad ogni residuo di ac. muramico è legato un
tetrapeptide costituito da

• L-alanina

• D-glutammico

• L-lisina

• D-alanina

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Organizzazione strutturale della parete
La parete cellulare dei batteri risulta
diversamente strutturata nei batteri Gram e nei
batteri Gram-. Tale diversa organizzazione
determina il differente comportamento dei batteri
alla colorazione di Gram permettendo di
effettuare una distinzione fondamentale dal punto
di vista clinico.
39
Parete cellulare Gram positivi
Costituente fondamentale il peptidoglicano,
formato da

• N-acetilglucosamina
• Acido N-acetilmuramico
• Tetrapeptide
• Ponte trasversale formato da 1 a 5 aminoacidi
  uguali o diversi tra loro

Dimensioni

• 80-90 mµ

40
Parete cellulare Gram positivi
Struttura

• Tridimensionale

• Costituita da numerose catene lineari, parallele
  tra loro, per uno spessore di 80-90 mµ dei due
  aminozuccheri legati con legame
• ß-glucosidico

• Ogni residuo di ac. muramico lega il
  tetrapeptide formato da aminoacidi
  alternativamente in configurazione L e D

• Il ponte trasversale collega due catene
  tetrapeptidiche poste su scheletri lineari
  adiacenti legando il 3 ed il 4 aminoacido della
  catena
• (L-lisina D-alanina)

41
Parete cellulare Gram positivi
Struttura

• Tridimensionale

42
Monomero costitutivo del peptidoglicano
E una molecola formata da una unità di
N-acetilglucosamina legata con legame ß 1-6
glucosidico ad una unità di ac. N-acetilmuramico
il quale lega il tetrapeptide ed il ponte
trasversale. Ogni monomero è legato al monomero
successivo tramite un legame ß 1-4 glucosidico.
Tale legame viene idrolizzato dallenzima
lisozima, il quale pertanto ha azione
depolimerizzante il peptidoglicano scindendone
cioè i vari monomeri costitutivi.
43
Altri costituenti la parete dei Gram

• Acidi teicoici
• Caratteristiche
• Lunghi filamenti che si protendono allesterno
  della cellula

Composizione chimica Esteri fosforici
del glicerolo e del ribitolo altamente
polimerizzati con gruppi OH variamente sostituiti
44
Funzioni degli acidi teicoici
Antigeni di superficie (utili per la
sierotipizzazione). Formano una fitta rete
allesterno della cellula ostacolando
lingresso delle sostanze a basso peso
molecolare. Con le loro cariche elettriche
negative formano un letto anionico capace di
attrarre cationi che fungono da cofattori per
taluni enzimi. Rendono possibile ladesione a
svariate superfici (adesine)
45
Altri costituenti la parete dei Gram
Proteine
Sono occasionalmente presenti in talune specie
es. Proteina A di Staphylococcus aureus (azione
antifagocitaria) Proteina M di Streptococcus
pyogenes (fattore di adesività condiziona
linvasività e la virulenza)
Lipidi
Sono presenti in alcuni generi e soprattutto in
elevata quantità nel genere Mycobacterium.
46
Parete cellulare dei batteri
Gram-positivi
Parete
ac. teicoico
47
Parete cellulare Gram-
Caratteristiche
E resa più complessa rispetto ai Gram dalla
presenza di una membrana posta esternamente ad
un sottile strato di peptidoglicano
Costituenti

• Membrana parietale esterna

• Peptidoglicano

• Spazio periplasmico

• Membrana citoplasmatica

I batteri Gram- rappresentano lunico esempio di
organizzazione cellulare delimitata da una
doppia membrana
48
Il peptidoglicano dei batteri Gram-

• Ha uno spessore minore rispetto ai Gram positivi
  (10-20µm)
• E composto da pochi scheletri lineari paralleli
  tra loro dei due aminozuccheri (N-acetilglucosamin
  a e N-acetilmuramico).
• Il 3 aminoacido della catena tetrapeptidica
  legata ad ogni residuo di acido muramico è
  lacido meso-diaminopimelico (L lisina nei
  Gram).
• Le catene tetrapeptidiche per il 50 sono
  sciolte, per il restante 50 sono legate tra loro
  con legame peptidico diretto realizzato tra il
  terzo aminoacido di una catena e il quarto della
  catena adiacente
• Struttura bidimensionale meno compatta rispetto
  ai Gram

49
Parete cellulare Gram-
Membrana parietale esterna

• Avvolge la cellula al di fuori del
  peptidoglicano
• Protegge la cellula batterica conferendole
  capacità di resistenza
• verso sostanze dannose.
• Presenta maggiore densità rispetto alla membrana
  citoplasmatica.
• Presenta caratteristiche di permeabilità del
  tutto peculiari che la
• rendono poco permeabile alle sostanze idrofobe
  e permeabile alle
• sostanze idrofile a basso peso molecolare.
• E collegata tramite delle lipoproteine al
  peptidiglicano sottostante.
• Ha una struttura tipicamente asimmetrica, il
  foglietto fosfolipidico
• più esterno è sostituito da un originale
  composto il lipopolisaccaride
• o LPS

50
Parete cellulare Gram-

• lipopolisaccaride
• Sostituisce il foglietto fosfolipidico più
  esterno, consiste di tre porzioni
• 1) una porzione lipidica (lipide A) rappresenta
  lendotossina cioè la frazione
• tossica. Al lipide A è legata una porzione
  polisaccaridica proiettata
• allesterno della membrana e composta a sua
  volta da due parti
• a) una catena di zuccheri (parte centrale o core)
  con struttura costante
• in tutti i Gram negativi appartenenti alla
  stessa specie
• b) una lunga catena polisaccaridica di
  composizione differente nei batteri
• appartenenti alla stessa specie con spiccate
  proprietà antigeniche
• (antigene O)
• Le catene polisaccaridiche presenti sulla
  superficie dei Gram- sono
• strutture polari in grado di legare cationi
  bivalenti formanti ponti
• che rendono la membrana assai compatta,
  tendenzialmente idrofila
• e capace di escludere i composti idrofobici.

51
La permeabilità della membrana esterna il
sistema delle porine
I batteri Gram- proteggono la cellula dalla
interazione con composti idrofobici dannosi
circondandosi di polimeri idrofili (core
polisaccaridico e antigene O). La compattezza
della membrana esclude tuttavia il passaggio di
sostanze idrofile essenziali al metabolismo. Per
assicurare il passaggio dei metaboliti, la
membrana è dotata di canali speciali per la
diffusione passiva di molecole idrofile. Questi
canali, chiamati porine, sono proteine che
presentano un foro centrale di lume limitato e
che si riuniscono in coppie o in trimeri
assicurando il passaggio delle sostanze
indispensabili al metabolismo. Lorganizzazione
della parete cellulare dei Gram- rende ragione
della particolare resistenza di tali batteri a
taluni farmaci e della loro presenza in
particolari distretti organici (ambiente
intestinale)
52
Periplasma o spazio periplasmico
E un comparto ben definito compreso tra il
peptidoglicano e la membrana citoplasmatica.
Ha la funzione di racchiudere e contenere in uno
spazio delimitato una serie di molecole proteiche
che garantiscono lesercizio di funzioni
fisiologiche importanti per il batterio.
53
Parete cellulare dei batteri
54
Sintesi del peptidoglicano
La via biosintetica che conduce alla sintesi del
peptidoglicano è fondamentale per comprendere il
meccanismo dazione di numerosi antibiotici che
debbono la loro azione allinibizione di tale
sintesi in taluni momenti essenziali.
La biosintesi del peptidoglicano è il processo
tramite il quale la cellula sintetizza ciascun
monomero di peptidoglicano.
Le fasi finali del processo, consistenti nella
estensione dei singoli monomeri in corti
polimeri, nella formazione di legami crociati tra
polimeri lineari e nel loro inserimento nella
parete deteminandone lallungamento è catalizzata
da enzimi capaci di legare covalentemente la
penicillina e gli altri ß-lattamici noti come
PBP (Penicillin-binding proteins).
55
Sintesi del peptidoglicano
56
Biosintesi del peptidoglicano
(a livello citosolico)
Nel citoplasma una molecola di N-acetilglucosamina
fosfato (NAG-P) si lega alluridintrifosfato
con formazione di UDP-NAG e liberazione di P
UDP-NAG si lega ad una molecola di
fosfoenolpiruvato in una reazione inibita
dallantibiotico fosfomicina (analogo
strutturale), formando UDP-NAG-piruvato
Il piruvato viene ridotto ad ac. lattico con
formazione di acido N-acetilmuramico o NAM
L NAM legato allUDP (UDP-NAM) funge da
accettore per i seguenti aminoacidi L-alanina,
D-glutammico, L-lisina e infine il dimero
D-alanina D-alanina (una racemasi trasforma
una L-alanina in D-alanina e una sintetasi
catalizza la formazione del dimero)
Linserimento del dimero è inibito
dallantibiotico cicloserina (analogo
strutturale) del dimero stesso
57
Biosintesi del peptidoglicano (a
livello della membrana)
LNAM-pentapeptide staccato dallUDP si lega ad
un vettore lipidico della membrana rappresentato
da una molecola di bactoprenolo
All NAM-pentapeptide legato al vettore lipidico
viene aggiunta una molecola di
N-acetilglucosamina con formazione di una unità
basale completa di peptidoglicano
Una serie di unità basali complete sono
polimerizzate e legate trasversalmente tramite
lintervento delle PBP1A e 1B che agiscono sia
da enzimi transglicosilanti (legame ß 1,4
glicosidico tra N-acetilglucosamina di una unità
e NAM dellunità adiacente) sia da enzimi
transpeptidanti (legami di transpeptidizzazione
tra polimeri lineari di peptidoglicano adiacenti
La polimerizzazione delle unità basali e la
liberazione dal vettore lipidico sono inibite
dai glicopeptidi (vancomicina e teicoplanina)
58
Biosintesi del peptidoglicano (a
livello della parete)
I corti polimeri di peptidoglicano, liberati dal
vettore lipidico, sono trasferiti allesterno
della membrana dove viene staccata la molecola
terminale di D-alanina e lenergia liberata
viene utilizzata per linserimento, ad opera di
altre PBP (2 e 3) dei frammenti polimerici nei
siti di allungamento della parete in
corrispondenza di tagli operati dalla PBP 4 che
rappresentano le zone accettrici le molecole
peptidoglicaniche neosintetizzate.
Tutte le operazioni terminali di
polimerizzazione, transpeptidizzazione e
inserimento delle unità peptidoglicaniche nella
parete catalizzate dalle PBP, risultano bloccate
dagli antibiotici ß-lattamici (penicilline e
cefalosporine) che agiscono legandosi alle
proteine enzimatiche e dagli antibiotici
glicopeptidici (vancomicina e teicoplanina) che
agiscono legandosi al dimero D-ala D-ala
impedendo la polimerizzazione.
59
Attivazione delle autolisine o
mureino-idrolasi
Lazione battericida dei farmaci in grado di
bloccare la biosintesi della parete non è
esclusivamente dipendente dal blocco della
sintesi del peptidoglicano, quanto
dallattivazione di enzimi autolitici
(autolisine) che avrebbero il compito di
rimuovere il tratto di peptidoglicano alterato.
In presenza del farmaco capace di bloccare la
sintesi del peptidoglicano, lazione delle
autolisine produce una breccia nella parete
favorendo la lisi osmotica e la conseguente
azione battericida del farmaco.
60
Protoplasti e sferoplasti

• Protoplasti derivati dei batteri Gram,
  ottenibili in laboratorio,
• privi di parete
  cellulare
• Sferoplasti derivati dei batteri Gram-,
  ottenibili in laboratorio,
• privi di parete
  cellulare
• Caratteristiche
• Presentano sempre forma rotondeggiante qualunque
  sia la forma originale
• (la parete è essenziale per definire la forma)
• Perdono la capacità riproduttiva (ruolo della
  parete per la vitalità cellulare)
• Devono essere mantenuti in ambiente con
  pressione osmotica uguale alla
• pressione osmotica interna per evitare la lisi

61
Come si ottengono i protoplasti o gli sferoplasti
in laboratorio?
I protoplasti si possono ottenere trattando i
batteri Gram con lisozima o con farmaci che
ostacolino la sintesi del peptidoglicano
(penicilline)
Gli sferoplasti, dal momento che la membrana
esterna è impermeabile al lisozima, possono
essere ottenuti rendendo la membrana esterna dei
Gram- permeabile al lisozima previo trattamento
con agenti chelanti i cationi come lEDTA. Si
ottengono così forme rotondeggianti che
mantengono tracce di membrana.
62
La fase L dei batteri
I batteri in fase L sono forme cellulari che si
ottengono in vivo, prive di parete cellulare.
Tali forme vengono isolate da varie affezioni ad
andamento subacuto o cronico. I batteri in fase
L a differenza dei protoplasti sono in grado
di riprodursi contribuendo alla cronicizzazione
dellinfezione. Leziologia batterica sostenuta
da batteri in fase L influenza sia la terapia (si
escludono antibiotici che interferiscono con la
sintesi del peptidoglicano) che la diagnosi
(tecniche particolari di isolamento).
63
Strutture polisaccaridiche esterne
Glicocalice
Il glicocalice è un complesso di sostanze per lo
più polisaccaridiche che avvolgono la cellula
batterica allesterno della parete cellulare,
rappresentate dallo strato cristallino o
strato S o dalla capsula. Il glicocalice, pur
non essendo una struttura essenziale per il
batterio è presente in tutte le fasi della vita
lasciando intuire un ruolo fondamentale nei
fenomeni di permeabilità selettiva e adesione
della cellula batterica prerequisito essenziale
di ogni processo infettivo.
64
Strato cristallino o strato S

• E uno strato formato da subunità proteiche
  spesso uguali tra loro, a volte
• legate a carboidrati disposte con una precisa
  simmetria cristallina, spesso
• associate in tetrameri, pentameri o esameri a
  formare un involucro pluristratificato
• che avvolge esternamente la cellula.
• Funzioni
• Rappresenta un ulteriore involucro protettivo
• Può intervenire nei fenomeni di adesione alle
  superfici mucose,
• momento fondamentale di ogni processo
  infettivo.

65
Capsula
E un involucro mucoso e amorfo che può essere
abbondantemente presente sia nei batteri Gram
sia nei Gram-
E il risultato della secrezione di materiali di
alta viscosità (etero o omopolimeri
polisaccaridici) che rimangono adesi alla
superficie esterna della cellula conferendo
proprietà di adesività a particolari superfici
con possibilità da parte del batterio di
colonizzare specifici distretti (superfici dei
denti, mucose etc.) o peculiari nicchie
ecologiche.
66
Composizione della capsula
Generalmente la capsula è costituita da
polisaccaridi (levani e destrani) polisaccaridi
complessi es. Streptococcus pneumoniae poliribitol
fosfati es. Haemophilus influenzae poli
D glutammato es. Bacillus anthracis
Qualunque sia la sua composizione, la capsula è
legata alle strutture sottostanti, direttamente
se le cariche elettriche sono di segno
opposto, altrimenti se le cariche sono dello
stesso segno (-), interverranno dei cationi che
effettuerannno legami a ponte tra la capsula e la
parete cellulare
67
Capsula
Funzioni

• Azione antifagocitaria
• impedisce la fagocitosi da parte dei fagociti
  dellospite (i batteri più invasivi che debbono
  attraversare il torrente ematico per raggiungere
  il bersaglio sono sempre capsulati)
• Strumento di adesione
• il materiale capsulare rappresenta un efficace
  strumento per ladesione batterica alle superfici
  mucose o inerti dellorganismo ospite
  contribuendo fortemente alla formazione di
  biofilm che favoriscono la persistenza del
  processo infettivo

68
Come si evidenzia nei batteri la presenza della
capsula?
La presenza della capsula si evidenzia
facilmente sospendendo i batteri in una goccia
di inchiostro di china ed osservando al
microscopio. I batteri provvisti di capsula sono
evidenti per lalone chiaro, non penetrato
dallinchiostro, di cui è circondata la cellula
batterica in contrasto con il fondo scuro delle
particelle di inchiostro.
69
Formazione della capsula
La formazione della capsula può essere
influenzata da
1. Fattori ambientali (presenza dei precursori
dei componenti capsulari)
2. Fattori genetici (presenza di geni capaci di
costituire il componente
capsulare es. capsula dello Streptococcus
pneumoniae)
70
Che cosè il biofilm?
Il biofilm è una formazione complessa formata da
unestesa matrice di materiale polisaccaridico
contenente numerosi batteri in grado di
interagire tra loro, che può invadere ampie zone
di mucosa quali la mucosa respiratoria
(infezioni da Pseudomonas nella fibrosi cistica),
le fasce connettivali intermuscolari (fascite
necrotizzante), superfici connettivali come le
valvole cardiache, oppure superfici di materiali
inerti introdotti a scopo terapeutico come fili
di sutura e vari impianti protesici (cateteri
vescicali, catetere venoso centrale, protesi
vascolari, protesi valvolari cardiache). Allinte
rno del biofilm i batteri sono relativamente
resistenti allazione degli effettori delle
difese antimicrobiche e rappresentano un più
difficile bersaglio per i farmaci
antibatterici. La crescita allinterno del
biofilm rappresenta pertanto una delle cause più
frequenti di infezioni persistenti e una delle
condizioni infettive di più difficile approccio.
71
Strutture appendicolari della cellula batterica
Alla superficie della cellula batterica possono
essere presenti una serie di appendici
rappresentate dai flagelli e dalle fimbrie o
pili. Si tratta di strutture proteiche
filamentose formate da monomeri capaci di
autoassemblarsi a formare strutture di varia
lunghezza, cilindriche che si protendono
allesterno della cellula.
72
Flagelli
Sono appedici molto sottili, di aspetto ondulato,
con spessore costantemente inferiore al potere
di risoluzione del microscopio ottico e assai
lunghe ( più lunghe della cellula a cui
appartengono) che si protendono allesterno
della cellula batterica. Sono organi di
propulsione, permettono cioè ai batteri di
muoversi. I batteri che hanno i flagelli sono
detti mobili, quelli che ne sono privi
immobili. Il movimento conferito dai flagelli è
un movimento vero più evidente rispetto ai
moti oscillatori (moti browniani) delle specie
immobili.
73
Come è possibile dimostrare la presenza dei
flagelli?
Lo spessore dei flagelli (120 ?) inferiore al
potere di risoluzione del microscopio ottico, ne
impedisce la visione allosservazione
microscopica a meno di non usare soluzioni di
sali (nitrato di argento), in grado di
depositarsi sui flagelli, ispessendoli e
permettendone la visione. La presenza dei
flagelli può essere dimostrata indirettamente
apprezzando il movimento dei batteri con un
metodo chiamato metodo della goccia
pendente. Tale metodica utilizza un particolare
vetrino più spesso dei vetrini portaoggetto con
una escavazione circolare centrale, chiamato
cellula di Koch.
74
Movimento dei batteri metodo della goccia
pendente

• Procedimento
• Si pone una goccia di sospensione batterica sul
• coprioggetti.
• Si ungono con vasellina i bordi del vetrino allo
• scopo di farlo aderire al vetrino cellula di
  Koch
• Si prende la cellula di Koch con la concavità
• rivolta verso il basso e si fanno aderire i due
  
• vetrini.
• Si capovolge il tutto, in modo che la goccia di
• sospensione batterica penderà allinterno
• della cavità. I batteri, allosservazione micro
• scopica, se mobili si muoveranno vivacemente,
• assai più rispetto alle specie immobili

75
Dislocazione dei flagelli sulla cellula batterica
La presenza dei flagelli, tranne rare eccezioni,
è una caratteristica esclusiva dei batteri di
forma cilindrica (bacilli, vibrioni e spirilli)
i quali a seconda della zona di inserzione dei
flagelli si distinguono in
Monotrichi un solo flagello polare
lofotrichi un ciuffo di flagelli polari
anfitrichi due flagelli polari
Peritrichi flagelli lungo il contorno
76
Struttura del flagello
I flagelli sono formati dalla ripetizione di
subunità di una particolare proteina chiamata
flagellina che si autoassemblano a formare una
struttura elicoidale. Le singole subunità
vengono sintetizzate dalla cellula, trasportate
lungo linterno cavo del flagello e depositate
allapice determinandone lallungamento. Le
flagelline di specie batteriche diverse, sono
differenti tra loro, sono dotate di spiccate
proprietà antigeniche e rappresentano lantigene
H dei batteri mobili
77
Ultrastruttura del flagello

• Ogni singolo flagello è costituito da tre parti
• Il filamento elicoidale che protrude dalla
  cellula (filament)
• Un gancio tubulare che attraversa gli strati
  esterni di
• diametro leggermente maggiore rispetto al
  filamento (hook)
• Un corpo basale che ancora il flagello alle
  strutture cellulari e rappresenta il motore del
  movimento rotatorio del flagello

78
Ultrastruttura del corpo basale
Il corpo basale è formato da subunità di almeno
15 proteine che si aggregano a formare una
struttura tubolare chiamata bastoncello e da una
serie di anelli, quattro nei batteri Gram
negativi, chiamati
Anello L (lipopolisaccaride) in corrispondenza
della membrana esterna
Anello P (peptidiglicano) in corrispondenza della
parete cellulare
Anello S (supermembrana) subito al di sopra della
membrana
Anello M (membrana) in corrispondenza della
membrana
Nei batteri Gram la struttura del corpo basale è
più semplice in rapporto alla diversa
organizzazione degli strati esterni e presenta
solo lanello M e quello S.
79
Il movimento dei flagelli

• Il movimento dei flagelli avviene attraverso la
  loro rotazione in corrispondenza
• del corpo basale e del gancio.
• I flagelli batterici non presentano, a
  differenza delle ciglia degli organismi
• eucarioti, movimenti ondulatori, bensì
  rotatori.
• Il movimento rotatorio dei batteri può avvenire
  in senso orario o antiorario.
• Essendo il passo dellelica sinistrorso, il
  movimento orario è più disordinato,
• quello antiorario risulta più direzionato.
• Il senso della rotazione (orario o antiorario) è
  condizionata da chemiorecettori
• di superficie che rispondono a stimoli
  ambientali.
• Lenergia che determina il movimento rotatorio è
  generata dal potenziale di
• membrana durante il trasporto di elettroni nel
  corso della fosforilazione
• ossidativa

80
Fimbrie o pili

• Sono appendici proteiche che si proiettano al di
  fuori degli involucri cellulari esterni
• Sono presenti solo nei Gram negativi (circondano
  la cellula)
• Originano dalla membrana citoplasmatica e si
  estendono per 0,2 µm
• allesterno.
• Sono formate dalla ripetizione di una o due
  proteine (piline) specifiche per le diverse
  specie batteriche, organizzate con simmetria
  elicoidale a formare rigide strutture cilindriche
• Alcune proteine, presenti allestremo libero
  delle fimbrie conferiscono loro la specifica
  capacità di legarsi a particolari substrati
  (adesine).
• Una particolare classe di pili è rappresentata
  dai fili F o pili sessuali.
• Sono più lunghi delle fimbrie adesiniche e
  svolgono un ruolo fondamentale nei processi di
  coniugazione batterica, permettendo lo scambio
  di materiale genetico.

81
(No Transcript)
82
Processo di sporulazione
Le spore batteriche sono cellule peculiari per
attributi morfologici e funzionali, capaci di
sopravvivere nellambiente esterno allo stato di
quiescenza. Vengono prodotte da un limitato
numero di specie per lo più saprofite. Tra i
batteri di interesse clinico, gli sporigeni più
importanti appartengono a due generi
sporigeni aerobi
Genere Bacillus
sporigeni anaerobi
Genere Clostridium

83
Processo di sporulazione
La produzione della spora non costituisce una
tappa obbligata del ciclo di sviluppo di uno
sporigeno, ma si verifica in seguito a condizioni
ambientali sfavorevoli (scarsa presenza di
nutrienti e di acqua). Nel batterio sporigeno
vanno perciò distinte due condizioni
alternative

laccrescimento vegetativo
Le cellule termolabili e metabolicamente attive
si dividono per scissione binaria alla massima
velocità consentita dalle condizioni ambientali
Vengono sintetizzati tutti i componenti
peculiari della spora
sporificazione
84
Significato della spora
La sporulazione va considerara come un processo
di differenziamento cellulare indotto dal
variare delle condizioni ambientali, e
rappresenta il risultato di informazioni
genetiche che, alternativamente espresse possono
consentire la formazione di due tipi cellulari
tra loro profondamente diversi
La spora
la forma vegetativa
85
La spora matura

• E profondamente diversa dalla forma vegetativa
  per composizione
• chimica, organizzazione strutturale, proprietà
  fisiologiche

• E termoresistente, disidratata, priva di
  evidente attività metabolica.

• E resistente a molti agenti fisici e chimici,
  antibiotici e solventi.

• E in grado, nonostante lestrema dormienza, di
  rispondere a
• determinati stimoli ambientali ed andare incontro
  al processo di
• germinazione che comporta interruzione dello
  stato di quiescenza
• e ritorno alla forma vegetativa.

86
La spora germinata

• E unentità termolabile
• Idratata
• Metabolicamente attiva
• In presenza di nutrienti, a concentrazioni non
  limitanti dà luogo ad una cellula capace di
  moltiplicarsi

87
Proprietà delle spore
Calore Essiccamento Congelamento Agenti
chimici Radiazioni
resistenza
quiescenza metabolica
disidratazione-rifrangenza
difficoltà tintoriali per scarsa assunzione del
colorante
88
Struttura della spora

• Dallinterno
• Protoplasto
• Membrana interna
• Parete sporale
• Corteccia sporale
• Membrana esterna
• Tunica profonda
• Tunica intermedia
• Tunica superficiale
• Esosporio

89
Protoplasto

• E assente lRNA messaggero
• Sono assenti enzimi per la biosintesi di alcuni
  aminoacidi
• Sono assenti enzimi per la biosintesi dei
  nucleotidi
• Sono assenti enzimi per la biosintesi degli acidi
  tricarbossilici
• E presente una copia del cromosoma batterico
• Sono presenti i componenti della sintesi proteica
• Sono presenti proteine enzimatiche e strutturali
• Sono presenti proteine di riserva
• Sono presenti gli enzimi per il trasporto
  terminale degli elettroni

90
Protoplasto (composti a basso p.
molecolare)

• Il protoplasto sporale è caratterizzato dalla
  presenza di composti a
• basso peso molecolare spesso complessati tra loro
  quali
• Acido dipicolinico (si forma da un intermedio
  della catena biosintetica della lisina, è
  presente solo nella spora, ne costituisce il
  5-15 del peso secco
• Aminoacidi (lisina, arginina, ac. glutammico)
• Poliammine (spermina e spermidina)
• Ioni (Ca)
• Acido 3 fosfoglicerico ( intermedio della
  glicolisi, rappresenta la riserva energetica
  della spora)

91
Stato chimico-fisico del protoplasto sporale
La caratteristica più saliente del protoplasto
sporale è la condizione chimico-fisica in cui si
trovano i suoi componenti a causa dellestrema
disidratazione e dellelevato contenuto di
molecole a basso peso molecolare. In assenza di
acqua tali composti favoriscono interazioni
dirette tra le macromolecole con formazione di
legami polari e non polari che portano alla
formazione di un gel denso ed esteso
chiamato matriceo stroma della spora.
Le macromolecole proteiche in assenza di acqua
vengono immobilizzate tramite la formazione di
legami realizzati dai composti a basso peso
molecolare, pertanto nella spora tali molecole
risultano inattive ma non denaturate.
92
Strato della corteccia
La corteccia è compresa tra la membrana interna e
quella esterna della spora. E costituita da
peptidoglicano disposto in diversi strati
concentrici intorno al protoplasto. E distinta
in due porzioni

• La più interna denominata parete della spora, ha
  struttura compatta,
• presenta numerosi legami trasversi e non va
  incontro ad autolisi
• durante la germinazione

• La più esterna è costituita da peptidoglicano
  più lasso
• 50 dei residui di ac. muramico non presentano
  il tetrapeptide
• 20 dei residui di ac. muramico legano una sola
  L-alanina
• 30 dei residui di ac. muramico legano il
  tetrapeptide completo
• Nel 10 si formano legami trasversi tra le
  catene tetrapeptidiche

93
Strato delle tuniche (coats)

• Costituisce il 50 del volume totale della spora
• E formato da numerosi strati proteici, densi,
  compatti, rigidi e
• sovrapposti.
• E costituito da proteine (80 delle proteine
  totali della spora).
• Le proteine sono ricche di cisteina, valina,
  ac. glutammico e lisina.
• La cisteina favorisce la formazione di legami
  disolfuro intra e
• inter-molecolari.
• Il risultato è una struttura rigida, poco
  deformabile, pluristratificata,
• resistente allazione enzimatica e a molti
  solventi.

94
Esosporio

• E la struttura più esterna della spora
• Non è sempre presente
• E di tipo membranoso
• La sua funzione non è chiara
• E formata da proteine, lipidi e polisaccaridi

95
Formazione della spora
Il processo di sporificazione evolve in stadi
morfologici successivi ed è il risultato di un
processo di differenziamento controllato da
informazioni genetiche espresse in sequenze
temporali definite.
1. Formazione del filamento assiale In
questo stadio il cromosoma si rilassa a formare
un filamento assiale disposto secondo
lasse maggiore della cellula.
2. Formazione del setto asimmetrico nella
cellula ad una estremità compare un setto che
divide il protoplasto in due comparti
diseguali contenenti ciascuno un cromosoma
completo, il comparto più piccolo sarà la
sede di formazione della spora.
3. Formazione della prespora In questo stadio
si ha la proliferazione delle membrane settali
con formazione di una duplice membrana che
circonda il comparto cellulare più piccolo
(pre-spora). Vengono sintetizzate proteine
che operano il trasporto attivo di aminoacidi e
ac. dipicolinico, permettendone laccumulo
nel protoplasto sporale

96

• formazione della corteccia o cortex
• Tra le due membrane viene stratificato il
  peptidoglicano utilizzando le stesse vie che
  nelle forme vegetative operano la sintesi del
  peptidoglicano della parete. Due enzimi
  specifici, sintetizzati allo scopo, determinano
  le modificazioni strutturali del peptidoglicano
  corticale. Si verifica accumulo di DPA e di Ca
  nel protoplasto e inizia acquisizione di
  termoresistenza
• formazione delle tuniche o coats
• Vengono sintetizzate proteine specifiche, ricche
  di zolfo, che vanno a
• costituire il rivestimento più esterno della
  spora.
• endospora matura
• In questa fase si completa la formazione degli
  involucri sporali e la
• spora viene liberata allesterno in seguito alla
  lisi dello sporangio.

97
Germinazione
E il processo in cui cessa la condizione di
spora e si ha il ripristino delle attività
vegetative. La trasformazione di una spora
quiscente in una forma vegetativa è il
risultato di 3 processi sequenziali

• Attivazione
• è un processo reversibile che rende le spore
  pronte a germinare, se
• esposte a specifici induttori della
  germinazione questi sono sostanze
• quali aminoacidi o nucleosidi che non vengono
  utilizzati come substrati dalla
• spora, ma piuttosto si legano a strutture
  recettoriali, determinandone
• modificazioni in grado di attivare il
  metabolismo degradativo.
• Lattivazione può essere indotta
  dallesposizione a temperature elevate o
• a seguito di eventi naturali come
  linvecchiamento e lusura degli strati.

98
Germinazione

• germinazione
• È un processo irreversibile caratterizzato da
  una serie di reazioni
• degradative che portano alla depolimerizzazione
  della corteccia,
• con leccezione della porzione più interna, ad
  opera di un enzima
• litico simile al lisozima e alla perdita di
  composti spora-specifici.

• esocrescita
• Lesocrescita della spora germinata si attua
  quando vengono forniti
• nutrienti a concentrazioni non limitanti.
• Durante lesocrescita si verificano una serie di
  eventi che ripristinano
• le condizioni metaboliche della crescita
  vegetativa

99
Riproduzione dei batteri
I batteri si riproducono per schizogonia o
divisione semplice una cellula madre cioè si
divide e forma due cellule figlie perfettamente
uguali tra loro, perché ciò possa avvenire è
necessario che il patrimonio genetico venga
egualmente ripartito, il DNA pertanto deve
potersi duplicare. Questo processo assicura la
corretta ripartizione del corredo genetico tra
le cellule figlie.
Il materiale genetico dei batteri (DNA)
è organizzato in ununica molecola di forma
circolare. Il processo di duplicazione ha
inizio da un punto di origine posto sulla
membrana citoplasmatica e termina dal lato
opposto
100
Fasi della riproduzione batterica
Duplicazione del cromosoma batterico il
materiale cromosomico, ancorato alla membrana
citoplasmatica, si duplica generando due nuovi
cromosomi ancorati ciascuno separatamente alla
membrana
Accrescimento delle membrane si verifica
laccrescimento delle membrane batteriche e il
conseguente allungamento della cellula, partendo
dalla zona di membrana che separa le due
strutture cromosomiche
Allontanamento delle strutture cromosomiche cont
inuando laccrescimento della cellula, le due
strutture cromosomiche si distanziano sempre di
più luna dallaltra
Separazione delle cellule figlie la separazione
è causata dalla formazione di un setto che parte
dalla membrana e si approfonda nel citoplasma in
direzione centripeta
Distacco delle cellule allinterno del setto di
membrana si forma un setto di parete permettendo
il definitivo distacco delle cellule. Se il setto
non si completa le cellule neoformate rimangono
unite in aggruppamenti spaziali caratteristici.
101
La curva di crescita dei batteri
I batteri, se le condizioni sono opportune per lo
sviluppo, si riproducono assai velocemente e il
loro numero aumenta in breve tempo.
Misurando la quantità di batteri presenti
nellunità di volume di un terreno liquido a
diversi intervalli di tempo, si può costruire un
grafico che rispecchia la cinetica del processo
replicativo della popolazione batterica della
coltura.
Il grafico ha un aspetto caratteristico, simile
per tutti i batteri e può essere suddiviso in
diverse fasi.
102
Curva di crescita fasi
Misurando il numero di batteri vivi presenti
in una unità di volume a vari intervalli di tempo
e riportando i valori in un diagramma ad assi
carte- siani nel quale in ascisse si pone il
tempo e in ordinate il log del numero dei
batteri vivi si ottiene una curva che può essere
suddivisa in 4 fasi.
1) Fase di latenza in questa fase non si ha
aumento nel numero dei batteri. La durata di
questa fase può essere molto diversa a seconda
delle specie batteri- che e delle condizioni di
coltura è dovuta alla neces- sità per i batteri
di sintetizzare gli enzimi necessari alla
metabolizzazione dei substrati presenti nel
ter- reno (fase di adattamento metabolico)
103
Curva di crescita fasi
2) Fase esponenziale o logaritmica Quando tutti
i batteri hanno terminato i processi metabolici
necessari alla riproduzione, inizia la
fase esponenziale nella quale si ha un rapido
incremento nel numero dei batteri in rapporto al
tempo. Questa fase non può durare allinfinito
poiché determina un rapido esaurimento di
nutrienti con allungamento del tempo di
moltiplicazione.
3) Fase stazionaria Il numero di batteri vivi si
mantiene costante, il mo- desto numero di
batteri che ancora si dividono bilan- cia quelli
che muoiono.
4) Fase di morte o di declino Il numero di
batteri cala progressivamente in quanto il numero
di batteri che muoiono supera quelli che
sopravvivono o ancora riescono a dividersi
104
Le colture continue
Normalmente si dice che una coltura è giovane,
quando è in fase logaritmica di sviluppo e
vecchia quando si trova in fase stazionaria. La
distinzione tra giovane e vecchia non riguarda la
cellula batterica ma è dovuta alle condizioni
del mezzo di coltura e alla disponibilità di
nutrienti.
E possibile mantenere una coltura batterica
giovane per il tempo che si desidera utilizzando
particolari sistemi di coltura (chemostati) in
cui da una parte si ha continua sottrazione di
terreno invecchiato e dallaltra si ha aggiunta
di uguale quantità di terreno fresco. In tal
maniera si mantiene indefinitivamente la coltura
in condizioni ottimali, per cui si ha la
moltiplicazione di tutti i batteri presenti.
105
La coltivazione dei batteri
Terreni di coltura sono dei substrati
artificiali nei quali è possibile coltivare (far
crescere e moltiplicare) i microrganismi in
laboratorio al di fuori degli ambienti
naturali. Coltivare i batteri è essenziale per
poterli studiare, per valutare i fattori che ne
influenzano lo sviluppo, per saggiare lattività
di sostanze dotate di attività antibatterica.
Requisiti dei terreni di coltura
Appropriato apporto di elementi nutritivi
Opportuno grado di umidità
Opportuno valore di pH
Idoneo potenziale ossido-riduttivo
Sterilità
106
Classificazione dei terreni di coltura
In base alle esigenze nutritive Terreni minimi
(contengono gli elementi essenziali per lo
sviluppo) Terreni generali (utili per quasi tutti
i microrganismi) Terreni per batteri esigenti
(contengono sostanze specificatamente richieste
da taluni microrganismi
In base alla composizione Terreni selettivi
(permettono lo sviluppo solo di taluni batteri in
quanto contengono sostanze che inibiscono lo
sviluppo degli altri) Terreni elettivi
(permettono lo sviluppo di un gruppo di batteri
senza impedire lo sviluppo degli altri) Terreni
differenziali (differenziano i batteri in base al
comportamento biochimico) Terreni selettivi e
differenziali (permettono lo sviluppo solo di
alcuni batteri e li differenziano in base al
comportamento biochimico
107
Classificazione dei terreni di coltura
In base alla consistenza Terreni liquidi
(consistenza liquida es. brodo) Terreni
solidificabili (brodo con aggiunta di 1,5-2 di
agar) Terreni semisolidi (ltquantità di agar utile
per la motilità batterica) Terreni coagulati
(contengono siero).
Lagar è un polisaccaride estratto dalle alghe,
non è utilizzato dai batteri come nutriente ma è
usato per rendere solido un terreno liquido.
Lagar fonde alla temperatura di 100, rimane
liquido fino a 45 e solidifica a temperatura
ambiente. I terreni a base di agar
1) assumono la forma del recipiente durante la
solidificazione
2) possono essere miscelati con sostanze
termolabili es. sangue
3) Offrono la possibilità di inoculare
sospensioni batteriche (agar germi)
108
Fattori che influenzano la crescita dei
microrganismi

• Temperatura (batteri psicrofili, mesofili,
  termofili)
• Ossigeno (aerobi, anaerobi, facoltativi)
• Anidride carbonica (5-10 necessaria per talune
  specie)
• Fattori di accrescimento (alcuni batteri non
  riescono a sintetizzare taluni metaboliti che
  debbono essere loro forniti)

109
Principi e tecniche di sterilizzazione
Definizione
la sterilizzazione è loperazione la quale,
mediante tecniche fisiche o chimiche, determina
luccisione di tutti i microrganismi (patogeni e
saprofiti) presenti in un materiale
La disinfezione, invece, con limpiego di
sostanze chimiche ad azione germicida determina
luccisione solamente dei patogeni.
La sterilizzazione si può ottenere
mediante calore (fiamma diretta, calore umido,
secco, vapore sotto pressione) filtrazione radiazi
oni gas
110
Sterilizzazione mediante calore
Fiamma diretta utilizza il becco Bunsen, serve
per sterilizzare lansa e per il flambaggio
dei bordi dei recipienti durante le operazioni
di apertura e chiusura.
Calore umido molto efficace, uccide i
microrganismi a temperature inferiori rispetto a
quelle utilizzate con il calore secco grazie alla
maggiore conducibilità termica del vapore. Si
attua con 1) liquidi caldi (acqua) bollitura,
pastorizzazione 2) Vapore fluente o sotto
pressione (sterilizzazione con vapore fluente,
tindalizzazione, autoclave)
Bollitura Si ottiene utilizzando liquidi alla
temperatura di 100, uccide i microrga- nismi in
forma vegetativa usata per siringhe, materiali
da medicazione.
Pastorizzazione Serve per ridurre la carica
batterica da un materiale ad es. il latte (prende
il nome da Pasteur).
111
Sterilizzazione mediante vapore fluente
Per vapore fluente si intende il vapore acqueo
alla temperatura di 100, esso possiede grande
forza di penetrazione. Un sistema impiegato per
formare vapore fluente è la pentola di Koch, un
recipiente a chiusura non ermetica allinterno
del quale lacqua bolle alla temperatura di 100.
Sterilizzazione frazionata (Tindalizzazione) Si