Tema 5

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Tema 5
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Plásmidos

• Su existencia en la Naturaleza. Importancia en la
  Transferencia Horizontal de genes en comunidades
  microbianas. Ocurrencia y abundancia en arqueas,
  levaduras y bacterias. Ventajas adaptativas.
• Tipos Circulares y Lineales. Modos de
  replicación.

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• Se conocen tres mecanismos generales por los que
  las bacterias pueden transferir lateralmente
  información genética
• conjugación,
• transformación
• y transducción

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• Estos mecanismos sexuales, o mas bien
  parasexuales, difieren en muchos aspectos de los
  mecanismos sexuales de los eucariontes
• Son unidireccionales, de un donador a un
  receptor se transfiere solo una fracción del
  genoma, que puede involucrar desde algunos pares
  de bases a cientos de kilobases, dependiendo
  principalmente del mecanismo de transferencia

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• La transferencia de genes ecológicamente
  adaptativos permite la diversificación y
  especiación bacteriana,
• Por lo que estos eventos tienen un gran impacto
  sobre la evolución de las poblaciones de estos
  organismos.

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• Esta es una de las grandes diferencias y ventajas
  del intercambio genético en bacterias con
  respecto al de los eucariontes las bacterias no
  tienen que reinventar la rueda
• La transferencia de genes, operones e islas
  genómicas crean nuevos linajes con combinaciones
  únicas que pueden explotar nuevos nichos y
  generar nuevas especies o ecotipos a través de
  uno o unos pocos eventos evolutivos

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• La transferencia horizontal de genes (HGT, por
  sus siglas en inglés) consiste en la transmisión
  del genoma o parte de éste de un organismo a otro
  que no forma parte de su descendencia.
• Por el contrario, el tipo de transferencia
  habitual, o transferencia vertical de genes, es
  la que se da desde un ancestro a su descendencia,
  como ocurre por ejemplo en la reproducción
  sexual.

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• Desde hace tiempo se conoce la importancia del
  proceso de HGT en procariotas, como en el caso de
  la conjugación bacteriana, con la mediación de
  plásmidos.
• Estos procesos son muy importantes como fuente de
  variación genética, equivalentes en cierto modo a
  la recombinación cromosómica de los organismos
  con reproducción sexual.

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• Sin embargo, la HGT en bacterias va más allá,
  dado que también se produce transferencia
  genética entre especies alejadas
  filogenéticamente,
• Lo cual permite la formación de genomas
  extraordinariamente heterogéneos y dinámicos.

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Qué es un Plásmido?

• El plásmido es una molécula circular de DNA que
  tiene una existencia independiente en la célula.
• Los plásmidos son muy abundantes en las
  bacterias, y mas escasos en las células
  eukariotas.
• Llevan en su seno varios genes, a menudo
  responsables de características útiles para la
  célula.

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• Por ejemplo, la capacidad para soportar
  concentraciones tóxicas de un antibiótico, como
  el cloranfenicol o la ampicilina.

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• Son elementos genéticos que se replican
  independientemente del cromosoma.
• Se encuentran dentro de la célula.
• Existen varios tipos de plásmidos.
• En E. coli, se han aislado mas de 300

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• Estos genes se emplean para seleccionar aquellas
  células que tienen un plásmido de las que no lo
  tienen.
• La mayoría de los plásmidos tienen una secuencia
  que sirve como orígen de replicación. Esto le
  permite replicarse independientemente.
• Los plásmidos mas pequeños emplean la maquinaria
  celular para su duplicación y mantenimiento.

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• Otros son capaces de integrarse en el cromosoma
  principal durante generaciones (episomas). Luego
  se pueden volver a escindir.

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• Están presentes normalmente en bacterias, y en
  algunas ocasiones en organismos eucariotas como
  las levaduras.
• Su tamaño varía desde 1 a 250 kb.
• El número de plásmidos puede variar, dependiendo
  de su tipo, desde una sola copia hasta algunos
  cientos por célula

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(No Transcript)
17
Tamaño y número de copia

• El tamaño de un plásmido es variable. (1
  kb-250kb).
• Como vector, es deseable que su tamaño no
  sobrepase 10kb.
• Ejemplos
• PUC8 2,1kb E. coli
• ColE1 6,4kb E. coli
• F 95 kb E. coli

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Tamaño

• Existe una amplia gama hasta plásmidos muy
  grandes (ciertos plásmidos de Pseudomonas tienen
  500 kb).
• Incluso existen megaplásmidos en ciertos
  Rhizobium que llegan a tener 1600 kb.

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Características de los Plásmidos

• Replicación autónoma
• Estabilidad
• Incompatibilidad
• Transferencia
• Plásmidos conjugativos
• Plásmidos no conjugativos
• Integración (Episomas)
• Confieren distintas propiedades fenotípicas

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Tipos de plásmidos

• P. conjugativos codifican pili sexuales y
  proteínas necesarias para la transferencia de
  DNA.
• P. R (resistencia a los antibióticos, mercurio).
• P. Producción de bacteriocinas y antibióticos.

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FENOTIPOS Y FUNCIONES DETERMINADOS POR PLÁSMIDOS

• Plásmidos de virulencia producción de toxinas,
  factores de penetración en tejidos, adherencia a
  tejidos del hospedador, etc., en ciertas
  bacterias patógenas.
• .

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• Plásmidos de virulencia producción de toxinas,
  enzimas, tumores. (E. coli O157 Toxina shiga)
• Plásmidos de funciones fisiológicas
• Utilización de urea,
• Fermentación de carbohidratos.
• Producción de pigmentos.

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• Producción de sideróforos (quelatos para
  secuestrar iones Fe3).

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• Utilización de hidrocarburos, incluyendo algunos
  cíclicos recalcitrantes (degradación de tolueno,
  xileno, alcanfor, etc.) en Pseudomonas.
• Inducción de tumores en plantas (plásmido Ti de
  Agrobacterium tumefaciens).
• Interacciones simbióticas y fijación de nitrógeno
  en ciertos Rhizobium

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Número de copias

• Cada tipo de plásmido tiene un número medio de
  copias por célula característico.
• Por regla general, los grandes plásmidos tienen
  una o dos copias por célula (plásmidos con
  control estricto de la replicación).
• Mientras que los pequeños suelen estar presentes
  como varias copias (gt10), denominándose plásmidos
  de control relajado.

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• E coli, posee un plásmido conjugativo llamado
  Factor F
• - Capacidad para sintetizar pili.
• - Movilización del DNA para su transferencia.
• - Alteración de receptores de la superficie de
  la célula.

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Conjugación

• Los plásmidos se pueden clasificar en dos grupos
  conjugativos y no conjugativos.
• Los conjugativos tienen la capacidad de promover
  la conjugación.
• El plásmido F de E. coli es capaz de integrarse
  en el cromosoma.
• Cuando la conjugación tiene lugar en esta
  situación, parte del cromosoma se transfiere a la
  cepa F-.

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• Solo los plásmidos conjugativos tienen la
  capacidad de ser transferidos en la conjugación.
• A veces, en presencia de un plásmido conjugativo,
  otro plásmido puede transferirse.
• A este mecanismo de conjugación se debe el
  surgimiento de la resistencia bacteriana a los
  antibióticos

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Conjugación en Gram negativos
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Conjugación en Gramnegativos

• Formación de pares efectivos
• Transferencia de ADN
• Origen de transferencia
• Replicación cadenas ADN

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Conjugación Importancia

• Bacterias Gram -
• Resistencia antimicrobianos
• Diseminación rápida
• Bacterias Gram
• Producción de factores de adherencia
• Resistencia antimicrobianos

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Compatibilidad

• Plásmidos distintos pueden encontrarse en una
  misma célula.
• En E. coli se han descrito hasta siete tipos
  distintos coexistiendo en una célula.
• Sin embargo, para ello, tienen que ser
  compatibles.

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• Algunos plásmidos se pierden rápidamente en
  presencia de otros, y por tanto, hay una serie de
  grupos de incompatibilidad.
• Las bases de la incompatibilidad no se entienden
  bien, pero parecen tener que ver con la
  replicación.

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INCOMPATIBILIDAD ENTRE PLÁSMIDOS Y GRUPOS DE
INCOMPATIBILIDAD

• Cada plásmido, dentro de la amplia diversidad de
  los que se conocen, se suele clasificar según el
  grupo de incompatibilidad al que pertenece.
• Los grupos de incompatibilidad se suelen
  denominar con las siglas Inc seguidas de una
  letra mayúscula (por ejemplo IncP, IncFII, etc).

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REPLICACIÓN

• Modelo de replicación en ? (theta)
• Separación de las dos cadenas en el sitio oriV,
  creando una estructura que se parece a la letra
  griega ? (theta).
• La replicación es unidireccional (sólo hay una
  horquilla de replicación , que avanza a lo largo
  de la molécula, hasta que vuelve al sitio oriV,
  en el que las dos moléculas hijas se separan).

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• Otros plásmidos se replican en ? por un modelo
  bidireccional (dos horquillas de replicación de
  sentidos opuestos, que se encuentran cerca de la
  mitad de la molécula).
• La replicación en ? es frecuente en plásmidos de
  bacterias Gram-negativas.

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Modelo de replicación en s (sigma), o modelo del
círculo rodante

• Una de las dos cadenas es rota a nivel de oriV,
  de modo que el extremo 3 suministra el cebador
  para la replicación de la cadena adelantada.
• La cadena desplazada (cadena menos) funciona
  como cadena retrasada (lagging) y debe ser
  replicada a partir de sitios de cebado
  especiales.
• Este tipo de replicación es frecuente en
  plásmidos de bacterias Gram-positivas.

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El mismo tipo de sistema de control del número de
copias y de reparto

• El número total de copias nAnB N (determinado
  por el sistema de control) no varía,
• Pero por fluctuaciones aleatorias en el reparto,
  algunas células heredan más copias de uno de los
  plásmidos que del otro, y tras varias
  generaciones aparecen células carentes de uno o
  del otro plásmido (nA 0 y nB N, o viceversa).

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• Cada plásmido contiene al menos una secuencia de
  ADN que sirve como un origen de replicación u ORI
  (un punto inicial para la replicación del ADN),
• Lo cual habilita al ADN para ser duplicado
  independientemente del ADN cromosomal.

40

• Los plásmidos de la mayoría de las bacterias son
  circulares, pero también se conocen algunos
  lineales, los cuales reensamblan superficialmente
  los cromosomas de la mayoría de eucariotes.

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Vectores de clonado

• Plásmidos, fago Lambda, cósmidos, y cromosoma
  artificial de levadura (YAC).

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• Un típico vector de clonado (Modelo de clonado)
• Contiene un sitio de policlonado( polilinker),
• Un gen de resistencia a Ampicilina (ampr) como
  marcador
• Y un origen de replicación (ORI).

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• Utilizando un plásmido se inserta y liga un
  fragmento con un gen de interés.
• Capacidad de almacenaje hasta 25 Kb.

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(No Transcript)
45

• Los plásmidos se utilizan en ingeniería genética
  como vectores de clonado por la facilidad con la
  que se manipulan.

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• Un vector plasmídico se fabrica a partir de
  plásmidos naturales cuyos segmentos innecesarios
  son eliminados, agregándose en cambio secuencias
  esenciales

47

• Para clonar una muestra de la ADN, se debe
  utilizar la misma enzima de restricción para
  cortar el vector y la muestra de ADN.
• Por lo tanto, un vector contiene generalmente una
  secuencia (polylinker) que pueda reconocer varias
  enzimas de restricción para poder utilizar el
  vector para clonar diversos fragmentos de ADN.

48
Características generales de los vectores de
expresión
- promotor - terminador - sitio de unión a
ribosoma - sitios único de corte de enzimas -
marcadores genéticos - orígen de replicación -
tamaño pequeño
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Vectores basados en plásmidospBR322

• Nomenclatura pBR322.
• Tamaño 4363pb. Capacidad hasta 10.000
• Contiene dos marcadores de resistencia Amp y
  Tet.
• Es un plásmido multicopia. Pueden encontrarse
  hasta 15 copias por célula. Utilizando
  cloranfenicol, puede aumentarse hasta 1000-3000.

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(No Transcript)
51
El mapa de pBR322
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pUC18 un plásmido avanzado

• Desciende de pUC8, a su vez de pBR322.
• Conserva el origen de replicación y ampR.
• La secuencia del marcador se ha alterado para
  eliminar los sitios de restricción.
• Estos se encuentran insertos en la secuencia de
  lacZ.
• Ventajas 500-700 copias/célula. Identificación
  directa empleando X-gal. Múltiples sitios para
  clonar (sitios de restricción).

53
Mapa de restricción de pUC18
54
El plásmido pGEM3
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Vectores basados en M13

• El genoma de M13 consiste de 6,4Kb, de los que la
  mayoría corresponde a 10 genes empaquetados.Todos
  son esenciales.
• Queda una región intergenica de 507 nucleótidos
  que tiene el origen de replicación ori.
• A pesar de estas dificultades, el hecho de que
  este vector se encuentra en forma monocatenaria
  lo hace muy atractivo para procesos de clonaje.

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Estrategias para desarrollar vectores basados en
M13

• Los vectores MP13mp contienen el gen LacZ.
• Los más modernos (mp7) tienen insertado un
  polilinker simétrico.
• O en su caso, polilinkers que permiten incorporar
  fragmentos con extremos cohesivos distintos,
  asegurando la orientación de la inserción
  (mp8/9).
• Existen otros vectores mixtos con plásmidos
  phagemids o fagómidos.

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CLONACIÓN MOLECULAR

• Aislamiento e incorporación de un fragmento de
  DNA dentro de un vector en el que puede replicarse

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Selección de recombinantes empleando la técnica
de la a complementación

• X-galactosa incorporado en la placa de cultivo
  permite la selección de las colonias que han
  incorporado el plásmido con el inserto
• - Colonias con inserto
• Se inactiva el gen LacZ, no hay a complementación
• Se observan colonias blancas
• Colonias sin inserto
• No se inactiva el gen LacZ, hay a complementación
• Se observan colonias azules

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Que representan las colonias blancas? Que
representan las colonias azules? Que colonias
utilizaría? Si nos olvidamos de colocar ATB en la
placa que resultado obtendriamos?
60
Qué pasó???????????????
61
Tres formas de plásmidos en los geles
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Bibliotecas genéticas o genotecas

• Son colecciones de vectores que colectivamente
  contienen todos los fragmentos de un organismo.
• Cuantos clones hacen falta para albergar un
  genoma?
• N ln(1-P)/ln(1-a/b)
• P la probabilidad de que un gen esté presente, a
  es el tamaño medio de fragmento y b es el tamaño
  total del genoma.

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Valores de N Tabla por especies
Especie Genoma (pb) nº clones
de
17kb de 35kb E.coli 4 x 106
820 410 S. cerevisiae 1.8 x 107
3225 1500 Arroz 5.7 x 108 100000
49000 Humanos 3.2 x 109 564000 274000
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ARCHAEA
BACTERIA
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Características

• Tienen una pared celular que brinda protección a
  los procariotas y les confiere su forma
  característica.
• Algunos procariotas se desplazan mediante
  flagelos simples.
• Las endosporas protectoras permiten a ciertas
  bacterias soportar condiciones adversas.
• Se reproducen por fisión binaria

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• Se especializan en hábitats específicos y
  presentan diversos metabolismos.
• Desempeñan muchas funciones que son importantes
  para otras formas de vida.
• Algunas bacterias constituyen una amenaza para la
  salud humana.

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BACTERIA y ARCHAEADiferencias

• La rígida pared celular que encierra las células
  bacterianas contiene peptidoglicano, pero las
  paredes celulares de las arqueas carecen de esta
  sustancia exclusivamente bacteriana y poseen
  pseudopeptidoglicano, glicoproteínas o proteína
  dispuesta en simetría hexagonal (capa superficial
  paracristalina-Capa S)
• La estructura y composición de otros componentes
  celulares como las membranas plasmáticas, los
  ribosomas y las ARN polimerasas.
• Las características fundamentales de procesos
  básicos como la transcripción y la traducción.

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• El grupo más antiguo, las arqueobacterias,
  constituyen un fascinante conjunto de organismos
  y por sus especiales características se considera
  que conforman un Dominio separado Archaea.
• Fenotípicamente, Archaea son muy parecidos a las
  Bacterias. La mayoría son pequeños (0.5-5 micras)
  y con formas de bastones, cocos y espirilos.
• Las Archaea generalmente se reproducen por
  fisión, como la mayoría de las Bacterias.
• Los genomas de Archaea son de un tamaño sobre 2-4
  Mbp, similar a la mayoría de las Bacterias.

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(No Transcript)
70

• Si bien lucen como bacterias  poseen
  características bioquímicas y genéticas que las
  alejan de ellas.
• Por ejemplo no poseen paredes celulares con
  peptidoglicanos
• Presentan secuencias únicas en la unidad pequeña
  del ARNr
• Poseen lípidos de membrana diferentes tanto de
  las bacterias como de los  eucariotas (incluyendo
  enlaces éter en lugar de enlaces éster)

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• Las arqueas existen en una gran variedad de
  hábitats, son una parte importante de los
  ecosistemas globales
• Cuatro grupos fisiológicos principales. Son los
  halófilos,
• termófilos,
• alcalófilos
• y acidófilos

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• Las arqueas, por lo general, tienen un único
  cromosoma circular al igual que las bacterias,
  que varía en tamaño desde 5.751.492 pares de
  bases en Methanosarcina acetivorans,
• El mayor genoma secuenciado hasta la fecha, hasta
  490.885 pares de bases en Nanoarchaeum equitans,
  el genoma más pequeño conocido que puede contener
  sólo 537 genes codificadores de proteínas.

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• Las arqueas también pueden presentar plásmidos
  que se pueden propagar por contacto físico entre
  células, en un proceso que puede ser similar a la
  conjugación bacteriana.
• Los plásmidos son cada vez más importantes como
  herramientas genéticas pues permiten la
  realización de estudios genéticos en Archaea

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Qué es una levadura?

• DominioEukaria
• ReinoFungi
• Principales
• Características Heterótrofos
• Unicelulares
• Pared celular de quitina
• Reproducción por gemación
• Metabolismo respiratorio (aeróbico) y
  fermentativo

75
(No Transcript)
76

• El genoma de levadura contiene un conjunto de 16
  cromosomas completamente caracterizados.
• Sus tamaños oscilan desde 200 a 2.200 kb.
• Se calcula que aprox. debe contener unos 6200
  marcos abiertos de lectura, o genes.

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Plasmidos en levadura

• Se conocen plásmidos en eucariotas.
• Los más conocidos son el plásmido de 2 micras en
  levaduras y los plásmidos que transmiten
  androesterilidad en el maíz, llamados S1 y S2
  presentes en las mitocondrias.
• El gran interés que despertaron estas partículas
  fue principalmente por su propiedad para
  transmitir la resistencia a los antibióticos y a
  sustancias tóxicas

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Plasmidos en levadura

• Ciertos vectores (YEP o Yeast episomal plasmids)
  contienen el origen de replicación de un plásmido
  natural de S. cerevisiae, el plásmido 2 µ (mu,
  letra griega).
• Tal vector se mantiene en forma de epísomos en
  número de 10 a 40 copias por célula (integrado al
  cromosoma).
• Los plásmidos que contienen las secuencias 2 µ
  son relativamente estables en la levadura, son
  transmitidos eficientemente a la descendencia
  durante la mitosis.

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Plasmidos en levadura

• Los vectores pESC constituyen una serie de
  vectores epítopes marcados diseñados para la
  expresión y el análisis funcional de genes
  eucariotas en la levadura S. cerevisiae.
• Estos vectores contiene los promotores GAL1 y
  GAL10 de levadura.

80
Plasmidos en levadura

• YCP ou Yeast centromere plasmidsOtros
  vectores (YCP o Yeast centromere plasmids)
  contienen un orígen de replicación cromosómico
  ARSH4 (Autonomous replicating sequence),
  secuencia de replicación autónoma y un centrómero
  CEN6 ellos están presente en número de 1 a 2
  copias por célula ..

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Plasmidos en levadura

• Los vectores pYCContienen el orígen de
  replicación para un número pequeño de copias
  CEN6/ARSH4 en levadura.
• Se encuentran disponibles con una variedad de
  marcadores de selección.
• A los vectores pYC también se los encuentra con
  una variedad de epítope tags (marcadores
  epitopes) para la detección y purificación de
  proteínas recombinadas.

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Plasmidos en levadura

• El vector pYC2/NT contiene un N-terminal
  Xpress-6xHis tag,
• Mientras que los vectores pYC2/CT y pYC6/CT
  contienen un C-terminal V5-His tag.
• Tanto el vector pYC2/NT como el pYC2/CT poseen el
  gen marcador URA3 para su selección.
• El vector pYC6/CT contiene el gen de resistencia
  al Blasticidina para su selección en levadura.

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Vectores de levaduras

• Tipos de vectores
• YIp integrativos una copia integrada al
  cromosoma
• YEp episomales ori 2m (alto número de copias)
• YCp centroméricos ARS, CEN (1 o 2 copias por
  cél)
• Promotores

Promoter Status Acid phosphatase PHO5 Ind
ucible Alcohol dehydrogenase I ADH
I Constitutive Alcohol dehydrogenase II ADH
II Inducible Galctokinase GAL
1 Inducible Metallothionein Cup
1 Inducible Phosphoglycerate kinase PGK Constit
utive Triose Phosphate isomerase
TPI Constitutive
21-Expresión proteínas-BM 2009
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Vectores episomales
Vectores centroméricos
22-Expresión proteínas-BM 2009
85
23-Expresión proteínas-BM 2009
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Expresión de proteínas en Pichia pastoris

1. Requiere técnicas simples para la manipulación
   genética (similar a S. cerevisiae)
2. Producción de altos niveles de proteínas (intra y
   extracelular)
3. Modificaciones post-traduccionales
   glicosilación, puente disulfuro, procesamiento
   proteolítico.
4. Kits de expresión disponibles.
5. Empleo del gen AOX1

Ampr, oriE mantenimiento en E. coli AOX1p
promotor de alcohol oxidasa. AOX1t secuencias
terminador transcripción. MCS sitio múltiple
clonado. HIS4 marcador biosintético. 3-AOX1
MCS
Diagrama general de un vector P pastoris shuttle
24-Expresión proteínas-BM 2009
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• Integración del vector de P. pastoris
• Se integran para maximizar la estabilidad del
  sistema de expresión.
• Corte del vector que lleva inserto de interés
  flanqueado por secuencias del gen AOX1 (para
  recombinación homóloga requiere regiones
  terminales mas largas que S cerevisiae.)
• Transformación con vector linealizado por
  electroporación o métodos químicos.
• Cepa huésped his4 pep4 prb1 (auxotrófica para
  Histidina y deficiente en proteasas).

Selección en medio his-
Cepa resultante aox1Muts Metanol crec lento,
alta producción prot.
25-Expresión proteínas-BM 2009
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Pichia methanolica Expression System
Expresión controlada por promotor AUG1 (alcohol
oxidasa) reprimido por glicerol o glucosa
Inducido por metanol a-factor péptido señal
para secreción de la proteína expresada. V5
epítope para detección con anticuerpos
anti-V5 6xHis tag polihistidina purificación
níquel-agarosa. ADE2 marcador biosintético.
26-Expresión proteínas-BM 2009
89
MUCHAS GRACIAS