Presentaci

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PRIMERA INVESTIGACIÓN ARGENTINA DE ENFERMEDADES
GENÉTICAS PEROXISOMALES Avance en la
Identificación Grupal y Desarrollo Metodológico
para la Individuación Patológica
Becaria Lic. Silvina Edith Bender
Directora Dra. Raquel Dodelson de Kremer
CEMECO
Centro de Estudio de las Metabolopatías Congénitas
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ENFERMEDADES GENÉTICAS PEROXISOMALES (EGP)
ERRORES INNATOS DEL METABOLISMO
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ENFERMEDADES GENÉTICAS PEROXISOMALES (EGP)
FUNCIONES PEROXISOMALES
CONSECUENCIA METABÓLICA
ácidos grasos de cadena muy larga ácido
trihidroxi-colestanoico ácido pristánico
colesterol plasmalógenos ácido fitánico ácido
pipecólico oxalato
MARCADORES BIOQUÍMICOS
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OBJETIVOS GENERALES DEL PROYECTO

• Continuar con el desarrollo del temario
  seleccionado en el campo de la Genética
  Médica-Bioquímica, área de Enfermedades Genéticas
  Peroxisomales (EGP), graves patologías
  neurodegenerativas previamente no abordadas en
  nuestro país.

• Contribuir a la difusión y utilización de un
  centro referencial en el país destinado a la
  contención del paciente, su familia y la
  sociedad, tendiente a disminuir el enorme impacto
  humano y económico que provoca la falta de
  diagnóstico en estas patologías.

• Integrar los objetivos hacia la Investigación
  Trasnlacional colaboración entre investigadores
  clínicos, laboratorios y pacientes para propugnar
  que los descubrimientos sean translacionales a la
  práctica asistencial y promover enérgicamente la
  Investigación Clínica en Genética Médica como
  herramienta básica para el progreso en el cuidado
  de la Salud.

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OBJETIVOS ESPECIFICOS DEL PROYECTO

1. Desarrollar la metodología bioquímica
   diagnóstica, destinada a la definición nosológica
   exacta de cada una de las entidades del amplio
   grupo de las EGP (Algoritmo Bioquímico).

1. Estudiar biomarcadores secundarios a las EGP,
   perfil de ácidos orgánicos urinarios y análisis
   molecular de polimorfismos, involucrados en la
   extraordinaria variación fenotípica interfamiliar
   e intrafamiliar. (focalización ALD-X)

1. Estandarizar los métodos para la medición de los
   metabolitos diagnósticos en muestras de sangre
   impregnadas en papel de filtro. (sensibilidad,
   reproducibilidad y estabilidad).

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ALGORITMO BIOQUÍMICO PROPUESTO
AGCML PLASMÁTICOS
AUMENTADO
NORMAL
ACIDOS ORGÁNICOS URINARIOS
ANORMAL
NORMAL
ALD-X
PLASMALÓGENOS ERITROCITAROS
DISMINUÍDO
NORMAL
Probable Defecto de ?-Oxidación/ Otras
Conrodisplasias
DBP/CDRP
ÁCIDO FITÁNICO PLASMÁTICO
NORMAL
AUMENTADO
NORMAL
AUMENTADO
Probable Deficiencia de Acil CoA-Oxidasa
RELACIÓN PRISTÁNICO/FITÁNICO
CDRP Tipo II y Tipo III
CDRP Tipo I
NORMAL
AUMENTADO
Probable Deficiencia de DPBF o Tiolasa Peroxisomal
Probable DBP
INTERMEDIARIOS DE AC. BILIARES (DHCA Y THCA)
AUMENTADO
NORMAL
NORMAL
Deficiencia de Acil CoA-Oxidasa
DBP
DPBF Tipo B
Estudios Histométricos Peroxisomales,
Determinaciones Enzimáticas y Análisis Molecular
EXACTA DEFINICIÓN NOSOLÓGICA
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ALGORITMO BIOQUÍMICO PROPUESTO
AGCML PLASMÁTICOS
AUMENTADO
NORMAL
ACIDOS ORGÁNICOS URINARIOS
ANORMAL
NORMAL
ALD-X
PLASMALÓGENOS ERITROCITAROS
DISMINUÍDO
NORMAL
Probable Defecto de ?-Oxidación/ Otras
Conrodisplasias
DBP/CDRP
ÁCIDO FITÁNICO PLASMÁTICO
NORMAL
AUMENTADO
NORMAL
AUMENTADO
Probable Deficiencia de Acil CoA-Oxidasa
RELACIÓN PRISTÁNICO/FITÁNICO
CDRP Tipo II y Tipo III
CDRP Tipo I
NORMAL
AUMENTADO
Probable Deficiencia de DPBF o Tiolasa Peroxisomal
Probable DBP
INTERMEDIARIOS DE AC. BILIARES (DHCA Y THCA)
AUMENTADO
NORMAL
NORMAL
Deficiencia de Acil CoA-Oxidasa
DBP
DPBF Tipo B
Estudios Histométricos Peroxisomales,
Determinaciones Enzimáticas y Análisis Molecular
EXACTA DEFINICIÓN NOSOLÓGICA
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METODOLOGÍA BIOQUIMICA
Cromatografía Gaseosa Capilar-Ionización a la
llama (CG-FID)
Ac. Grasos de Cadena muy Larga (AGCML)
Ac. Orgánicos Urinarios (AOU)
Ac. Grasos Ramificados (AGR)
Biomarcadores Secundarios
Metabolitos Primarios
Orina 5 ml
Plasma 250 µl
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METODOLOGÍA DEL ANÁLISIS MOLECULAR
Polimorfimos del Metabolismo de la Metionina
Parámetros no convencionales a las EGP
5,10-Metilenetetrahidrofolato Reductasa (MTHFR)
Sustitución 677CgtT de la MTHFR
Mayor vulnerabilidad desmielinización
Digestión de producto de PCR con enzima de
restricción HindI. Electroforesis en gel de
poliacrilamida 6 (Frosst 1995)
Cistationina Beta-Sintasa (CBS)
Efecto protector desmielinización
Inserción 844ins68 de la CBS
Separación de productos de PCR por electroforesis
en gel de agarosa 3. El alelo wild type
produce un fragmento de 596 pb y la insersión uno
de 664 pb. (Urreizti 2003)
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INTEGRACIÓN DEL ALGORITMO BIOQUÍMICO A LA
COMPATIBILIDAD CLÍNICA
Evaluación Clínica
Clasificación Fenotípica de ALD-X
Patrones de Lesión anatómica Loes 2003
Severidad de Afectación Loes 1994
Fenotipos Moser HW 1997, 2001
Cerebral Infantil Cerebral Juvenil Adrenomieloneur
opatía Cerebral Adulto Addison Aislado
Asintomático Portadoras Sintomáticas
Clasificación de RMN en 5 grupos
Escala de severidad de RMNespecífica para ALD-X
de 0 - 34 puntos
Parieto-Occipital Frontal Cortico-Espinal Cerebela
r Parieto-Occipital y Frontal
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Metabolitos Primarios ALD-X
Definición o aproximación diagnóstica por
determinación de AGCML
C240 (µg/ml)
C24/C22
C26/C22
C260 (µg/ml)
Pacientes
ADL-X
Normal
0,84 0,08
0,01 0,01
13,34 3,78
0,22 0,08
Valores de Referencia
ALD-X Hemicigota
1,49 0,45
1,18 0,53
0,07 0,04
25,12 4,83
ALD-X Heterocigota
1,09 0,34
0,03 0,02
25,43 6,04
0,70 0,40
BN (14 a/F)
0,94
Heterocigota
ND
12,91
ND
BE (11 a/M)
Hemicigota -CI
1,54
15,48
0,78
0,09
No Afectado
0,80
13,34
BN (9 a/M)
ND
ND
BML (4 a/F)
No Afectado
0,68
ND
10,43
ND
BI (4 a/M)
0,06
23,92
0,74
Hemicigota- Asintomático
1,44
Hemicigota- Asintomático
0,05
21,79
BM (2 a/M)
1,61
0,92
Heterocigota
VG (madre)
0,02
26,90
1,25
0,51
AGCML y AGCR en plasma
Asnt
EB
IB
MB
BMT
Asnt
CI
AA
AA
12
INTEGRACIÓN DE METABOLITOS PRIMARIOS Y
BIOMARCADORES SECUNDARIOS, A LA COMPATIBILIDAD
CLÍNICA
Familia EB
Asnt
677CT
RMN patrón 1
EB
IB
MB
RMN patrón Normal
TMO
parieto-occipital
Asnt
CI
AA
AA
RMN Score 0
RMN Score 4
677CT
677CT
10y
7y
11y
11y
EB
IB
MB
EB
Extensive involvement of periventricular white
matter with temporal extension. Involvement of
the splenium and body Corpus callosum, internal
capsule, peduncles and protuberance
RMN Cerebral Normal
RMN Cerebral Normal
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INTEGRACIÓN DE METABOLITOS PRIMARIOS Y
BIOMARCADORES SECUNDARIOS, A LA COMPATIBILIDAD
CLÍNICA
Familia OR
Tracto corticospinal
OR
41
OR
RMN Cerebral Normal
OR
Sint
Sint
Sint
Marked slimness of the spinal cord. Diffuse
atrophy
677 CC
677 CT
?
?
?
10
10
OR
19
Asnt
AMN
CI
CI
CI
CI
Asnt
677 CC
?
?
?
?
?
?
?
?
9
CI
14
Biomarcadores secundarios en EGP,
específicamente en ALD-X
Biomarcadores Moleculares
Variación Fenotípica inter/intrafamiliar
Controles n95
X-ALD Hemicigotos n9
X-ALD Heterocigotas n11
Polimorfismos Estudiados
CI
AA
AMN
Asnt
Sint
Asnt
-
-
-
-
-
-
11
MTHFR 677TT
1
2
1
-
1
3
MTHFR 677CT
45
1
2
1
1
5
2
MTHFR 677CC
39
0
-
-
-
-
-
-
CBS InsIns
2
-
-
-
-
-
CBS WIns
10
2
4
2
1
6
3
CBS WW
85
15
Caracterización del perfil de Ácidos Orgánicos
Urinarios
PERFIL AOU NORMAL
PERFIL AOU Adrenoleucodistrofia Neonatal
1) lactato, 2) oxalato, 3) cresol, 4) piruvato,
5) 3-OH-butirato, 6) gliceraldehído I, 7)
3-OH-isovalerato, 8) gliceraldehído II urea, 9)
fosfato etilmalonato, 10) succinato, 11)
adipato, 12) piroglutamato, 13)
m-OH-fenilacetato, 14) p-OH-fenilacetato, 15)
2-cetoglutarato, 16) aconitato, 17) hipurato,
18)citrato, 19) estándar interno, 20) palmitato,
21) oleato, 22) estearato, 23 24) p-OH-hipurato
1) lactato, 2) oxalato, 3) piruvato, 4) adipato,
5) p-OH-fenilacetato, 6) 2-cetoglutarato, 7)
sebàcico, 8) p-OH-fenillactato, 9)estándar
interno, 10) 3-OH sebàcico, 11) 3-6
epoxitetradecanedioico
Hipotonía, dismorfias faciales, retraso
psicomotor, convulsiones, cliteromegalia y
disfunción hepática
300 metabolitos en corrida cromatográfica
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Estimación preliminar de avance del proyecto
El estado de avance de la aplicación del
Protocolo Clínico-Bioquímico posibilitó

• Efectuar el diagnóstico o aproximación
  diagnóstica de EGP en nuestro medio.
• Brindar una posta asistencial no disponible con
  anterioridad y evitar una larga deambulación
  diagnóstica de la afección en cuestión.
• Definir en alta proporción el estado de portadora
  de ALD-X, entidad de aparente alta prevalencia
  en nuestra población.
• Precisar el asesoramiento genético en las
  familias involucradas, acorde a los conocimientos
  científicos actuales.
• Brindar el adecuado manejo del paciente, según su
  específica EGP.

17
(No Transcript)
18
Deficiencias de una Unica Proteína Peroxisomal
(DUP)
Fenotipo Bioquímico
Función Metabólica Alterada
Enzima/Proteína Afectada
Fenotipo Clínico
PALD
X-ALD
Acil-CoA Oxidasa
P-ALDN
? AGCML
?- Oxidación de Acidos Grasos
D-Proteína Bifuncional
P-SZ/ALDN
Tiolasa I
P-SZ
Racemasa
Neuropatía tardía
?Plasmalógenos
Biosíntesis de Etherfosfolípidos
DHAPAT
CDRP
Alkil-DHAP Sintasa
? AGCR
?-Oxidación de Acidos Grasos
Fitanoil-CoA hidroxilasa
ER
? Acido Pipecólico
Degradación de Acido Pipecólico
? No identificada
Hiperpipecolico Acidemia(variab)
Metabolismo Glutaril-CoA
Glutaril-CoA Oxidasa
Glutarico Aciduria III
Metabolismo H2O2
Catalasa
Acatalasemia
? Acido Oxállico, Glioxílico
Detoxificación Glioxilato
Alaninaglioxilato Aminotransferasa
Hiperoxaluria I
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A. Defectos de la Biogénesis Peroxisomal (DBP)
Genes Involucrados
PEX 26, PEX 10, PEX 6, PEX 16, PEX 1, PEX 2, PEX
13, PEX 19, PEX 5, PEX 12
Sindrome de Zellweger (SZ)
PEX 26, PEX 10, PEX 6, PEX 1, PEX 3, PEX 13, PEX
5, PEX 12
Adrenoleucodistrofia Neonatal (ALDN)
Enfermedad de Refsum Infantil (ERI)
PEX 26,PEX 10, PEX 6, PEX 1, PEX 5, PEX 12
Condrodisplasia Rizomelica Punctata (RCDP) tipo I
PEX 7
B. Deficiencias Enzimáticas Aisladas
Genes Involucrados
ß-Oxidación de Ácidos Grasos
Adrenoleucodistrofia Ligada al Cromosoma X (ALD-X)
ABCD1
Deficiencia de Acyl-CoA Oxidasa (ACOX1)
ACOX1
Deficiencia Proteina D-Bifunctional (PDB)
HSD17B4
Deficiencia Proteina Transportadora de Sterol-X
(SCPx)
SCP2
Deficienciencia 2-Methylacyl-CoA Racemasa (AMACR)
AMACR
Biosintesis Eterfosfolipidos
Deficiencia Dihidroxiacetona fosfato
aciltransferasa (DHAPAT) (CDRP Tipo II)
GNPAT
Deficiencia Alquil-DHAP sintasa (CDRP Tipo III)
AGPS
a-Oxidacion de acidos grasos
PHYH/PAHX
Enfermedad de Refsum (Deficiencia de Fitanoil-CoA
hidroxilasa)
Metabolismo del Peróxido de Hidrógeno
Acatalasaemia (Deficiencia de Catalasa)
CAT
Detoxificación del Glioxilato
Hyperoxaluria Tipo I (Deficiencia de Alanina
Glioxilato Aminotransferasa)
AGXT
C. Sindrome de Gen Contiguo
Sindrome de Deleción Contigua ABCD1 DXS1357E
(CADDS)