Introduction la biologie molculaire

1
Introduction à la biologie moléculaire

• ADN / ARN
• STRUCTURES / FONCTIONS

2
Introduction

• 50 du poids sec de la plupart des cellules
  protéines

• Protéine polymère (chaîne) d'acides aminés

• Chaque protéine est caractérisée par sa séquence
  d'acides aminés.

Ex. le lysozyme (126 AA)
3
Introduction

• On connaît actuellement 8000 protéines
  différentes.
• On en découvre une centaine de nouvelles par
  mois.
• Nombre total de protéines que peut fabriquer
  l'organisme humain ??? (quelque chose entre 50
  000 et 150 000).

• Chaque cellule fabrique les protéines dont elle a
  besoin.
• Pour fabriquer une protéine, il faut deux choses

• Des acides aminés.
• La  recette  quels acides aminés faut-il
  assembler et dans quel ordre ?

4
Introduction
 Recettes  contenues dans le noyau
Noyau contient une matière appelée chromatine
Chromatine protéines appelées histones et
d'ADN ADN  recettes  des protéines
5
Introduction

• Crick et Watson, 1953
• Découverte de la structure de la molécule
• d'ADN
• ADN et ARN acides nucléiques
• Les acides nucléiques polymères de nucléotides

6
Introduction

• NUCLÉOTIDE ose base azotée acide
  phosphorique

Base azotée
Groupement phosphate
5
1
4
Sucre
2
3
7
Introduction

• Lose pentose cyclique

5
OH
HOH2C
1
4
2
3
OH
Désoxy-ribose

• Lacide phosphorique

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Introduction

• Les bases azotées puriques ou pyrimidiques

Uracile
9
ADN structure

• ADN Acide DésoxyriboNucléique
• Polymères de nucléotides reliés entre eux par
  des fonctions esters
• Ose désoxyribose
• Les bases Adénine, Guanine, Cytosine et
  Thymine
• Si on sépare une molécule d'ADN en nucléotides,
  on obtient toujours
• AT et GC
• Pourquoi ?

1
4
5
3
2
3
5
Liaison 3OH-5P
10
ADN structure

• Hypothèse de Crick et Watson A peut s'apparier
  avec T et
• C avec G

11
ADN structure

• Donc la molécule dADN est formée de 2 brins de
  nucléotides
• Ces deux brins ont trois propriétés essentielles
  
• antiparallèles
• complémentaires
• hélicoïdaux

12
ADN structure

• L'orientation entre les liaisons donne une
  structure en forme de double hélice à pas droit
  
• Les plans des bases sont perpendiculaires à
  laxe de lhélice
• Donc les bases sempilent

13
ADN structure

• 10 paires de base par pas de lhélice
• Pas de lhélice 3,4 nm
• Diamètre de lhélice 2 nm
• Les brins antiparallèles délimitent deux
  sillons de taille inégale les sillons mineur
  et majeur
• Certains atomes des bases sont accessibles dans
  les sillons permettant la reconnaissance
  spécifique dune séquence dADN

14
ADN des différents être vivants

• Dans tous les organismes
• Support de linformation génétique
• Structure en double hélice (sauf certains virus)
• Différences
• Nombre de molécules dADN 1 pour E. Coli et 46
  pour lHomme
• Longueur quelques milliers de nucléotides à
  plusieurs millions
• Forme linéaire ou circulaire
• Localisation dans la cellule séparé ou non du
  cytoplasme par une membrane
• Séquence en bases
• Virus génomes les plus petits (quelques
  milliers de nucléotides) à ADN ou à ARN

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ADN des différents être vivants

• Procaryotes ADN dans le cytoplasme
• Un seul chromosome  circulaire  continu
  Plusieurs millions de nucléotides
• Présence de plasmides petits morceaux dADN
  circulaires, indépendants de lADN principal
• Eucaryotes ADN dans le noyau
• Plusieurs chromosomes avec ADN fortement
  compacté et linéaire
• Plusieurs milliards de nucléotides
• ADN associé à des protéines
• Cas de lADN des mitochondries
• ADN circulaire
• Code génétique différent de lADN nucléaire
• Transmission maternelle uniquement

ADN
Histones
16
ARN structure

• ARN Acide RiboNucléique
• Polymères de nucléotides reliés entre eux par
  des fonctions esters
• Ose ribose
• Les bases Adénine, Guanine, Cytosine et
  Uracile
• ARN un seul brin
• Appariement entre 2 ARN différents, entre un
  brin dADN et un brin dARN ou sur lui même A
  avec U et G avec C

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Les différents ARNs

• ARNr ARN ribosomique
• Participent, avec les protéines ribosomiques, à
  la formation des ribosomes (molécules
  nécessaires à la synthèse des protéines)
• ARNt ARN de transfert
• Transfert les acides aminés vers le lieu de
  synthèse des protéines
• ARNm ARN messagers
• Portent linformation génétique de lADN vers
  le lieu de synthèse des protéines
• ARNsn ARN small nuclear
• Présent dans le noyau uniquement
• Participent à la régulation post-transcriptionnell
  e

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Propriétés physico-chimiques des acides
nucléiques

• Propriétés importantes pour lisolation et
  létude des acides nucléiques
• Stabilité Liaisons H spécificité de
  lappariement des bases
• Interactions hydrophobes et aromatiques
• Solubilité solubles dans phénol, solutions
  salines et alcalines
• Précipités par lalcool et les solutions
  acides fortes
• En solution aqueuse, ils sont très acides
• Viscosité ADN long et mince donc solution très
  visqueuse
• Densité environ 1,7 g/cm3, isolation possible
  sur gradient de césium
• Dénaturation chimique par lurée ou le
  formamide
• thermique ARN dénaturation progressive à
  la chaleur
• ADN dénaturation à une température précise
  (Tm) dépendant du contenu en G-C (propriété ayant
  permis la création de la PCR)

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Propriétés physico-chimiques des acides
nucléiques

• Propriétés importantes pour lisolation et
  létudes des acides nucléiques
• Absorption UV Les bases absorbent dans lUV
  avec un maximum
• à 260 nm
• Quantification concentration déterminée par
  labsorption à 260 nm
• solution à 1mg/ml dans une cuve de 1 cm,
  A26020
• Pureté de lADN utilisation du rapport
  A260/A280
• Si A260/A280 gt 1,8 contamination par ARN
• Si A260/A280 lt 1,8 contamination par
  protéines

20
Le code génétique

• ADN Lieu de stockage de linformation
  génétique
• Sous forme CODÉE chaque protéine est codée par
  un gène (ou plusieurs si la protéine est
  polymérique)
• Lunité de base des protéines est lacide
  aminé
• Chaque acide aminé est codé par un codon
• Codon triplet de nucléotides (ex AGC
  Ser)
• Pourquoi utiliser un code de trois nucléotides ?
• 4 nucléotides
• Si 2 nucléotides 1 acide aminé
• On ne disposerait que de 16 acides aminés (24)
• Si 3 nucléotides 1 acide aminé
• On disposerait de 64 acides aminés (34)
• Or il existe 20 acides aminés différents

21
Le code génétique (déchiffré entre 1960 et 1964)
N.B. 64 combinaisons pour 20 acides aminés. Code
redondant (il est dit dégénéré) plusieurs
triplets différents peuvent coder pour le même
acide aminé. Trois triplets signifient la fin du
message triplets STOP
22
Le code génétique Propriétés

• Dégénéré Un acide aminé est codé par plusieurs
  codons
• Universel Identique chez tous les êtres
  vivants
• Exception ADN mitochondrial (4 codons sont
  différents)
• Non chevauchant Les codons sont lus en série
  depuis un point de départ jusquau codon stop

23
La notion de gène

• Un segment d'ADN portant toute l'information
  nécessaire pour la synthèse d'une protéine
  gène
• Gène de de la protéine Phé-Arg-Leu-Phé-Leu

24
La notion de gène

• Les gènes chez les procaryotes contiennent
• Une zone dinitiation de la transcription
• Une zone de terminaison de la transcription
• Une partie codante

25
La notion de gène

• Les gènes chez les eucaryotes contiennent
• Une zone dinitiation de la transcription
• Une zone de terminaison de la transcription
• Une partie codante composée dintrons et dexons

26
La notion de gène

• Les Exons sont des régions de lADN contenant
  linformation génétique (régions traduites)
• Les Introns sont des régions de lADN qui seront
  éliminés lors de la maturation des ARNm (régions
  non traduites)

27
De lADN à la protéine

• Linformation génétique nest transmise que dans
  un sens

• Exception les Virus à ARN

28
La réplication de lADN

• Cest le mécanisme de transmission de
  linformation génétique dune cellule mère à ses
  cellules filles
• LADN des cellules filles est identique à celui
  de la cellule mère
• La réplication est semi-conservative
• Chaque molécule dADN est constituée
• dun brin parental et
• dun brin néoformé

29
La réplication chez les procaryotes

• Les différents acteurs
• LADN parental matrice
• Les nucléotides sous forme triphosphate dATP
  (désoxy Adénosine TriPhosphate)
• Les enzymes (séparation des brins,
  incorporation des nucléotides)
• Co-facteurs (ex Mg)
• La réplication se déroule de 5 vers 3, de
  façon complémentaire et antiparallèle
• La réplication est bidirectionnelle

O origine de réplication T terminus
30
La réplication chez les procaryotes

• La réplication est discontinue pour lun des
  deux brins
• Brin avancé synthèse dans le sens de la
  propagation
• Brin retardé synthèse  à reculons 

Sens de propagation de la réplication
31
La réplication chez les procaryotes ex E. coli

• Linitiation de la réplication
• Réplication débute dans une région précise
  (lorigine de réplication) ORI C
• Fixation du complexe multimérique de DnaA
• Ouverture de la double hélice
• Fixation des protéines DnaB (hélicase)
• Fixation des protéines SSB stabilise les
  simples brins dADN
• Fixation de lADN polymérase (Pol I et Pol III)

32
La réplication chez les procaryotes ex E. coli

• Lélongation
• Lhélicase DnaB ouvre la double hélice en aval
  de la polymérase
• Synthèse des amorces ARNs par la primase
• Lincorporation des nucléotides du brin avancé
  seffectue par Pol III
• La synthèse des fragments dOkasaki débute par
  Pol III
• et se termine par la digestion et le
  remplacement des amorces dARN par la
  polymérase I (Pol I) et leur liaison par la
  ligase

Fragments dOkasaki
Brin avancé
33
La réplication chez les procaryotes ex E. coli

• La terminaison
• Les deux fourches de réplication se rencontrent
  à 180 dORI,
• au niveau des sites Ter
• La protéine Tus inhibe laction de lhélicase,
  donc les deux molécules dADN double brins
  restent liées
• Dissociation par la topoisomérase IV

Initiation
Élongation
Terminaison
ORI
Sites Ter
Topoisomérase IV
34
La réplication chez les eucaryotes

• Mécanisme comparable aux procaryotes
• La réplication est bidirectionnelle,
  complémentaire, antiparallèle, simultanée pour
  chaque brin mais discontinue pour lun des deux
  brins
• Elle seffectue dans le sens 5-3, avec des
  amorces dARN
• Mais comme le génome est plus grand et réparti
  sur plusieurs chromosomes, il existe plusieurs
  sites dinitiation sur chaque chromosome
• La réplication débute simultanément au niveau de
  plusieurs sites dinitiation

35
La transcription

• Mécanisme de synthèse des ARNs
• ARNm copie dune portion dADN (gène)
• Tout lADN nest pas transcrit (région
  codante/non codante)
• Synthèse dans le sens 5-3
• de manière antiparallèle par rapport à lADN
  copié
• de façon complémentaire
• Les différents acteurs
• Matrice dADN
• Nucléotides sous forme triphosphate ATP, CTP,
  GTP UTP
• RNA polymérase (plusieurs sous-unités abbs)
• Cofacteurs (Mg)

36
La transcription chez les procaryotes

• Initiation de la transcription
• Par convention 1 1er nucléotide transcrit
• -1 nucléotide précédent le 1er nucléotide
  transcrit
• ARN polymérase doit reconnaître les gènes à
  transcrire
• Le promoteur séquence dADN en amont de la
  région transcrite du gène, qui est
  spécifiquement reconnue par lARN polymérase
• Séquences 35 et -10 séquences à environ 35 et
  10 paire de base en amont du site dinitiation,
  3 bases fortement conservées (TTGACA et TATATT)

37
La transcription chez les procaryotes

• Initiation de la transcription
• LARN polymérase se fixe sur lADN grâce aux
  séquences 35 et 10
• LADN double brin est dénaturer entre les
  position 10 et 1

38
La transcription chez les procaryotes

• Élongation
• ARN polymérase ajoute des nucléotides à
  lextrémité 3 de lARN en cour de synthèse.
• Elle avance dans la direction 3 vers 5 du
  brin matrice

3
UUACU
G U A
ARN en cour de synthèse
5
Sens de la transcription
39
La transcription chez les procaryotes

• Terminaison
• Terminateur séquence dADN formant une
  structure secondaire de type épingle à cheveux,
  suivie dune région riche en AT
• Transcription du terminateur
• Formation de lépingle à cheveux sur lARN
• Ralentissement de lARN polymérase
• Arrêt et décrochage de lARN polymérase

40
La transcription chez les procaryotes

• Modification post-traductionnelle
• Peu ou pas de modification des ARNm
• Traduction débute avant la fin de la
  transcription

41
La régulation de la transcription chez les
procaryotes

• Lopéron Lactose
• Séquence dADN contenant
• Gènes lac Z, lac T et lac A,codant pour enzymes
  nécessaires à lutilisation du lactose par la
  bactérie (gènes de structure)
• Un promoteur unique pour les trois gènes (ARN
  polycystronique)
• Séquence opérateur élément de contrôle de la
  transcription
• Gène régulateur lac I codant pour le répresseur

42
La régulation de la transcription chez les
procaryotes

• Lopéron Lactose
• E. coli utilise le lactose quand il est la seule
  source de carbone disponible
• Fonctionnement
• Inducteur lactose, allolactose et IPTG
  (isopropylthiogalactopyranoside)
• Absence dinducteur
• Le promoteur de lac I permet la transcription
  du gène lac I, donc la synthèse du répresseur
  (lac)
• Formation de tétramère lac
• Fixation du tétramère lac sur la région
  opératrice O lac
• blocage de la transcription des gènes de
  structure

43
La régulation de la transcription chez les
procaryotes

• Lopéron Lactose
• Présence dinducteur
• Inducteur se fixe sur le tétramère lac
• Changement de conformation et perte de laffinité
  pour Olac
• Transcription des gènes de structure

• Inducteur épuisé
• Tétramère lac se fixe sur Olac
• Transcription bloquée

44
La transcription chez les eucaryotes

• Mécanisme similaire, mais beaucoup plus complexe
• Plusieurs ARN polymérase
• ARN polymérase I ARNr
• ARN polymérase II ARNm, ARNsn
• ARN polymérase III ARNt
• Nombreux cofacteurs protéiques nécessaire à la
  fixation de lARN polymérase sur lADN
• Structure des gènes des eucaryotes
• Gènes fragmentés
• Exons ADN contenant linformation génétique
  (traduit en acides aminés)
• Introns séquences intercalaires, fonctions ?

45
La transcription chez les eucaryotes

• Les différentes phases de la transcription
• Étapes nucléaires
• Transcription intégrale du gène (exons introns)
• Addition du  cap  en 5
• GMP méthylé sur lazote 7 (donc charge )
• Mise en place rapide (avant la fin de la
  transcription)
• Liaison au 1er nucléotide par une liaison
  anhydride
• Protection de lARNm des enzymes de dégradation
• Addition de polyA
• Après transcription, addition denviron 250 A
• Aide passage vers cytoplasme
• Étapes cytoplasmiques
• Maturation du pré-ARNm
• Épissage coupure et élimination des introns

46
La traduction

• Les éléments nécessaires
• Les acides aminés
• 20 acides aminés
• Relié entre eux par une liaison peptidique
• Liaison entre COOH porté par le Ca de lacide
  aminé n1 et
• le NH2 porté par le Ca de lacide aminé n2
• Les ARNm
• Les ARNt
• adaptateurs entre lARNm et les acides aminés
• Fait correspondre un codon à un acide aminé
  précis par lintermédiaire dun anticodon
  complémentaire

47
La traduction

• Linitiation
•  codon initiateur ,  codon signal  AUG
  situé à environ 100 pb de lextrémité 5 de
  lARNm, indiquant le début de la traduction
• AUG Met toutes les protéines commencent par
  une méthionine (qui sera clivée lors de la
  maturation de la protéine)
• Ribosome complexe protéiques ARNr permettant
  la formation de la liaison peptidique
• Petite sous-unité sassocie avec lARNm au
  niveau du codon AUG et avec lARNt portant la
  Met
• Grande sous-unité se fixe à la petite sous-unité

48
La traduction

• Lélongation
• 1ère étape
• Accrochage dun nouvel ARNt-AA dans le site A
• Codon n2 (après lAUG) détermine lARNt, donc
  lAA
• 2ème étape
• Rupture liaison entre Met et le premier ARNt
  (élimination)
• Formation de la liaison peptidique entre la Met
  et lAA n2
• 3ème étape
• Translocation le ribosome se décale dun codon
  vers 3 de lARNm, donc lARNt n2 passe sur le
  site P et le site A (libre) acceille lARNt n3

49
La traduction

• La terminaison
• Seffectue quand le ribosome rencontre un codon
  stop
• Aucun ARNt se fixe en face de ce codon
• Coupure liaison entre le dernier AA et son ARNt
• Dissociation du ribosome et libération de lARNm

• N.B un même ARNm peut servir de matrice à
  plusieurs ribosome en même temps polysome

50
Altérations et réparation de lADN

• Mutations
• Accidents de copie des bases
• Le plus souvent au cours de la réplication
• ADN fils ? ADN parental
• Mutations ponctuelles
• substitution remplacement dune base par une
  autre
• délétion perte dune base
• insertion ajout dune base
• Transmission des mutations
• Procaryotes mutation transmise aux descendants
• Eucaryotes supérieurs mutation transmise
  uniquement si elle touche les cellules sexuelles
• Mutations ARN
• Possible mais moins importante car pas de
  transmission à la descendance et nombre de mutant
  lt nombre de sauvage

51
Altérations et réparation de lADN

• Effet des mutations
• Mutations silencieuses
• Changement de base ne modifie pas lAA (ex UUU
  ? UUC Phe)
• Mutations conservatrices
• Changement de base induit un changement dAA,
  mais ayant les mêmes propriétés (ex AAA
  (Lys) ? AGA (Arg) 2 AA basiques)
• Mutations faux sens
• Changement de base induit un changement dAA,
  nayant pas les mêmes propriétés (ex AAA (Lys,
  basique) ? GAG (Gly, acide))

52
Altérations et réparation de lADN

• Effet des mutations
• Mutations du codon stop
• Changement dun codon AA en codon stop protéine
  tronquée
• Changement dun codon stop en codon AA protéine
  allongée
• Mutations avec changement du cadre de lecture
• Due aux délétions ou insertions

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Altérations et réparation de lADN

• Conséquences des mutations
• Avantages principe de lévolution individus
  portant la mutation sont mieux adaptés à leur
  environnement
• Maladies ex Anémie falciforme maladie
  génétique caractérisée par une hémoglobine
  anormale. Anomalie dans la chaîne ß de
  l'hémoglobine
• 6e acide aminé VAL alors qu'il devrait être
  GLU (T remplace A)

54
Altérations et réparation de lADN

• Mutation de certains gènes peut participer à
  lapparition de tumeur
• Ex gènes contrôlant la division cellulaire

• Tumeur bénigne

• Les cellules demeurent regroupées et ne se
  séparent pas.
• La tumeur demeure bien circonscrite.

• Tumeur maligne

• Des cellules se détachent de la tumeur principale
  et vont former d'autres tumeurs dans le corps
  cancer

55
Altérations et réparation de lADN

• Mutation de certains gènes peut participer à
  lapparition de tumeur
• Ex gènes contrôlant la division cellulaire

Tumeur du cerveau
Tumeur du sein
56
Altérations et réparation de lADN

• Réparation de lADN
• La plupart des mutations sont corrigées par des
  enzymes de réparation au cours de la réplication
• Enzymes reconnaissent brin néoformé car il nest
  pas encore méthylé
• Endonucléases coupent lADN en amont ou en aval
  de la mutation
• Exonucléases coupent lADN jusquà la mutation
• ADN polymérase III comble la brèche selon le
  modèle du brin parental
• Ligase relie les deux parties
• du brin néoformé