Epigenetika - metylace DNA

1
Epigenetika- metylace DNA
2
Metylace DNA u Eukaryot

• nemetylovaná DNA kvasinka Saccharomyces
  cerevisiae,
• octomilka Drosophila (málo), kroužkovci, hlístice
  Caenorhabditis
• savci 3-8 cytosinových zbytku, CG sekvence
• (u embryonálních kmenových bunek i v non-CG
  kontextu)
• - nízký výskyt CG v repetitivních
  heterochromatinových
• oblastech (mutageneze)
• rostliny 25-30 cytosinových zbytku ( velikosti
  genomu)
• predevším v repetitivních heterochromatinových
  oblastech
• (pravidelný výskyt nemetylovaných míst SAR,
  MAR)
• - u vetších genomu (obiloviny) ostrovy
  transkripcne aktivní
• DNA s nižším obsahem metC
• metC (CG) je ale i v kódujících sekvencích
  exprimovaných genu!!!

3
Mechanismus metylace DNA
- metylace bází - cytosinu a adeninu (bakterie
restrikce cizorodé DNA) u Eukaryot je biologicky
významná metylace cytosinu na C5 purinového
kruhu (u savcu i hydroxymethylC)
H
H
H
H
N
N
N
N
C
C
SAM
N
O
N
O
cytosine
5-methyl cytosine
4
Metylace DNA cílové sekvence
- symetrické (palindromatické) sekvence i
nesymetrické sekvence 5 -------CG-------CHG--
--------C---C------G--C---- 3 3
-------GC-------GDC----------G---G------C--G----
5
?
(H A, T nebo C D A,T,G)
Symetrické sekvence snadné udržování pri
replikaci hemimetylovaný stav je signálem pro
udržovací metylaci ----CG-------------
CHG---------- C ------- ---------CG ----
---- G C------------ G DC-----------G
------- ---------G C---- -----CG
-------------CHG -----------C-------- -----GC
-------------GDC-----------G-------- Asymetrické
sekvence nutno neustále metylovat de novo
(principielne je ale
také udržovací) - signál metylace
histonu a sRNAs
5
Cílová místa metylace DNA v chromatinové
strukture

• Preferencní metylace exonu
• souvislost s preferencním výskytem nukleosómu
  na exonech (spoludefinování prechodu intron
  exon a exon intron)
• (soucasne zvýšený výskyt polymerázy II - zbrždení
  nukleozómem)
• - bránení inkorporaci H2A.Z
• Preferencní výskyt metC na vnejší strane
  nukleozómu
• souvisí s preferencním výskytem C-G na vnejší
  strane (stérické duvody)
• lépe prístupný pro metyltransferázy

6
Predpokládaná korelace prítomnosti
H2A.Z, metylace DNA a míry/regulovatelnosti
exprese
( )
Coleman-Derr and Zilberman 2012
- metylace DNA brání inkorporaci H2A.Z - H2A.Z
neumožnuje stabilní expresi (house-keeping genu)
7
Analýzy metylace DNA

• Prímé (strukturní)
• spektrofotometrie, HPLC (celkový stav)
• - metC
• anti metC protilátky (na chromozómu )
• - lokalizace metC bohatých úseku chromozómu
• pomocí restriktáz citlivých k metylaci
• - detekce metC v konkrétním restrikcním míste
• hydrogensiricitanovým sekvenováním
• - presné urcení C a metC v urcité sekvenci
• - i v celém genomu (v kombinaci s moderními
  technikami sekvenování)
• Neprímé (funkcní) vztah mezi metylací a genovou
  expresí
• - napr. sledování reaktivace umlcených genu

8
Analýzy metylace DNA
pomocí restrikcních endonukleáz citlivých k
metylaci - štepení, Southernova hybridizace
- PCR, elektroforéza (méne spolehlivé) (izolace
krátkých na geny bohatých fragmentu u velkých
genomu - kukurice) A -----------C
CGG-----------------------------------CmetCGG-----
---------------------C CGG--------------------
-- B -----------C CGG-----------------------
------------C CGG--------------------------C
CGG---------------------- -
štepení restriktázou citlivou k metylaci cílové
sekvence PCR primer
elektroforéza a Southern
PCR a elektroforéza
A B
A B
9
Analýzy metylace DNA

• hydrogensiritanová modifikace,
• shotgun sequencing
• nebo PCR sekvenace
• 1. denaturace
• ---------C---------C--------CC---C------C-------
  -----C--
• 2. modifikace Cyt na Ura
• (5metC zustává nezmenen)
• ---------C---------U--------UU---C------U-------
  -----U--
• 3. PCR, sekvenace
• puvodní sekvence
• ---------C---------C-------- CC---C------C--------
  ----C--
• ---------G---------G--------GG---G------G---------
  ---G--
• modifikovaná sekvence
• ---------C---------U--------UU---C------U---------
  ---U--

10
Analýza metylace u Arabidopsis Chromosome
epigenetic landscape
?
?
11
Mutace zprostredkované metylací C
C T
replikace reparace
T
A

• Evoluce genu
• zdvojení sekvencí (napr. po polyploidizaci)
  navodí metylaci
• metylace navodí reversibilní inaktivaci
• mutace metC muže navodit irreversibilní
  inaktivaci
• kopie genu muže být postupne masivne mutována
• (bez selekcního tlaku)
• - vznik a reaktivace genu s novou funkcí

12
Genom Arabidopsis - statistika
13
Rostlinné cytosin 5-metyltransferázy - 3 rodiny
u Arabidopsis
MET1 (metyltransferase) CMT3 a CMT2
(chromomethyltransferase) DRM2 (a DRM1) (domain
rearranged methyltransferase)
14

• MET1 (metyltransferase1)
• - príbuzná savcí Dnmt1
• - udržovací metylace symetrických CG
• - asociovaná s replikací
• spoluúcast komplexu remodulujícího nukleosómy
  DDM1
• (u heterochromatinových sekvencí)
• Signál hemimetylovaná CG sekvence

15

• CMT3 (chromomethyltransferase3)
• - unikátní pro rostliny a houby (príbuzné savcím
  Dnmt1, ale navíc obsahují chromodoménu doménu
  interagující s metLys
• - asociovaná predevším s konstitutivním
  heterochromatinem (repetitivní sekvence, TE -
  retrotranspozóny)
• udržovací metylace sekvencí CHG
• zrejme kooperace s DDM1 (nukleozómy remodelující
  protein)
• Aktivita podmínena dimetylací histonu H3 na
  lyzinu K9 - (interakce zprostredkovaná
  chromodoménou)

16

• CMT2 (chromomethyltransferase2)
• - príbuzná CMT3, rovnež obsahuje chromodoménu
• - asociovaná s konstitutivním heterochromatinem
• udržovací metylace sekvencí CHH
• kooperace s DDM1 (nukleozómy remodelující
  protein)
• Aktivita podmínena dimetylací histonu H3 na
  lyzinu K9 (interakce zprostredkovaná
  chromodoménou)

17

• DRM2 a 1 (domain rearranged methyltransferase)
• príbuzné savcím Dnmt3, ale mají preskupené
  domény
• DRM1 v casné fázi vývoje semen
• udržovací metylace asymetrických sekvencí CHH
  (CHG)
• regulace genové exprese, silencing
• nutná spoluúcast katalyticky neaktivního
  paralogu DRM3 u
• Arabidopsis
• Cílové sekvence jsou urceny prítomností
  homologních siRNA
• RNA-directed DNA Methylation (RdDM)

18
Udržovací metylace DNA
Heterochromatin s histonem H1 - strední cásti
dlouhých TE (kódující sekvence) - nutná úcast
chromatin remodel. faktoru DDM1 - metylace
rízena H3K9me2 (CHH, CHG) CMT2, CMT3
metylací (CG) MET1 Chromatin bez histonu H1 -
okraje TE, krátké TE, geny - úcast chromatin
remodel. faktoru DRD1 - metylace rízena
predevším siRNA (RdDM) DRM2 (RdDM rízena
H3K9me2 a nemetyl. H3K4) - metylace CG rízena
metylací MET1
19
Udržovací metylace transpozónu
Zemach et al. 2013
20
Demetylace DNA
1) pri replikaci s vyloucením aktivity
udržovacích cytosin metyltransferáz (a
histonových metyláz) 2) DNA glykosylázy (odštepen
í metylcytosinu, reparací doplnen cytosin)
ROS1 REPRESSOR OF SILENCING somatické bunky (k
demetylaci nutný ROS3 protein vázající RNA
sRNA ? mRNA) DEMETER-LIKE (DML2, DML3)
somatické bunky DME1 DEMETER parentální
imprinting (endosperm)
21
Demetylace DNA
ros1 dml2 dml3
nárust metylace

• ROS1 REPRESSOR OF SILENCING
• DEMETER-LIKE (DML2, DML3)
• aktivní ochrana genu (promotoru) pred
• metylací (príp. modulace transkripce)
• - mutace v demetylacních genech se projeví
  predevším nárustem metylace v 3 a 5 UTR
• V metylacních (metyltransferázových) mutantech je
  demetylace utlumena (zpetná vazba).

metylace
WT
22
Ovlivnování metylace DNA
- aplikace 5-azacytidinu blokování aktivity
MET1 - dihydroxypropyladenin (DHPA) ovlivnení
hladiny SAM - (inaktivace genu MET1, DDM1, CMT3,
) Projevy - ruzné žádné až výrazné zmeny
fenotypu (zpusobené TE) - pohlavní reverze u
knotovky (andromonoecie), fenotyp cycloidea u
lnice,
23
Reaktivace umlcených transgenu 5-azacytidinem
- inhibitor MET1 (5-azacytidin, AzaC)
AzaC
AzaC
Demethylated
- obnovení casto jen prechodné!
Nocarová, Fischer, nepubl.
24
Stérické dusledky metylace DNA- interpretace
metylace DNA

• zmeny na úrovni histonu
• - posttranslacní modifikace histonu
• - SRA domény metylace (SUVH family),
• - Metyl CpG-binding d. deacetyl. (HDAC)
• - zastoupení ruzných forem histonu (H2A.Z)
• zmena vazby jiných interagujících proteinu
• - regulátoru (aktivátoru a represoru)
  transkripce
• - proteinu zodpovedných za
  strukturu/modifikace
• chromatinu

25
príklad MBD proteiny (metyl-CpG-binding
domain) - rostlinné MBD proteiny nemají
TRD (transcription repression domain) -
specifita vazby je dána i dalšími interagujícími
proteiny - AtMBD5 interaguje i s CHH - MBD
proteiny zrejme interagují s histon
modifikujícími proteiny (HDAC histon
deacetylázy)
Model komprimace chromatinu vazbou dimerizujícího
AtMBD7 proteinu
26
Autokatalytická smycka - metylace CHG (CMT3) a
metylace H3K9 (KYP, KRYPTONITE) - transkripce
indukuje demetylaci H3K9me2 (IBM1)
ROS1/ ROS3
??? x DRM2
Obdobné snížení množství H3K9me2 u mutantu kyp a
cmt3
co je defaultní stav?
27
Metylace DNA a stav chromatinu - prehled

• - prokázána korelace hypermetylace a
  hypoacetylace histonu (pozdní replikace DNA)
• - metylace DNA je dedicným signálem k deacetylaci
  histonu a kondenzaci chromatinu
• obdobné fenotypové zmeny pri potlacení metylace
  (MET1) a deacetylace histonu (AtHD1)
• prítomnost formy histonu H2A.Z (typické pro
  promotorové sekvence aktivních genu) se vzájemne
  vylucuje s DNA metylací !!!

28
Metylace DNA a stav chromatinu

• - di(tri-)metylace H3K9 (KYP) je signálem pro
  metylaci CHG
• - metylace CHG je signálem pro metylaci H3K9
• k demetylaci H3K9 (IBM1) zrejme dochází v
  souvislosti s transkripcí
• demetylace DNA prostrednictvím ROS1 vyžaduje RNA
  vazebný ROS3 (???)
• trimetylace H3K4 je typická pro euchromatin a
  vzniká v souvislosti s transkripcí (aktivní DNA)

29

• Udržování epigenetického stavu
• prehled
• Neaktivní chromatin
• - MET 1 udržovací metylace CG
• KYP (SUVH5,6) H3K9me2 ? CMT3 - CHG (CMT2
  CHH)
• DRM2, (DRM1) udrž. metylace CHH ? komplement.
  siRNA
• Aktivní chromatin
• IBM1 demetylace H3K9 ? transkripce
• ROS1/ROS3, DML2, DML3 demetC ? transkripce?,
  sRNA?

30
Vzájemná provázanost metylace DNA a struktury
chromatinu
metC modifikace dvoušroubovice DNA
post- translacní modifikace a formy histonu
vazba interagujících proteinu TF, RNA
pol., MBD,
31
Úloha a projevy metylace DNA

• dedicná (mitoticky a cástecne i meioticky)
  modulace transkripce - genové exprese
• - obranný mechanismus vuci invazní DNA
  (transpozóny)
• - regulace genové exprese (ontogeneze,
  diferenciace a bunecná pamet, reakce na stres)
• - parentální imprinting
• modulace struktury chromatinu (prícina i
  následek)
• - casování DNA replikace
• - regulace homologní rekombinace (meiosa)
• - definování hranic exon-intron
• nástroj evoluce
• - genomu polyploidních rostlin (rozsáhlé zmeny
  metylace)
• - nových genu (mutageneze pseudogenu)

32
Metylace DNA u Arabidopsis Silná metylace v
repetitivních heterochromatinových oblastech
centromery Metylace v kódujících sekvencích
genu u více než 30 exprimovaných genu
(metylace predevším u genu se stredne silnou
expresí) Metylace v promotorech u méne než 5
genu (geny s vývojove a pletivove specifickou
expresí)