Sejarah perkembangannya:

1
Sejarah perkembangannya 3000 s.M ? minuman
beralkohol (melalui fermentasi) namun
dasar-dasar ilmiahnya baru
pada abad ke-17. 1680 Leeuwenhoek ? amati
bentuk sel-sel khamir. 1818 Eryleben mulai
ketahui fermentasi oleh sel-sel khamir. 1857
Pasteur penemuan fermentasi asam laktat. 1897
Buchner jelaskan enzim yg berperan dlm
fermentasi memahami proses fermentasi
diikuti penemuan2 lain dlm bidang mikrobiologi
? mikrobiologi merupakan salah satu
dasar utama perkembangan bioteknologi. 1928
Griffith menemukan mutan bakteri Pneumococcus
tipe R (non-patogenik) dpt alami
transformasi ? tipe S (patogenik).Pnemococcus
tipe R hidup campur dg tipe S yg mati
? injeksikan pd tikus ? tikus mati. Isolasi darah
tikus tsb. terdpt strain tipe S yg
hidup. Perubahan tipe R (hidup) ? tipe S (hidup)
bersifat permanen. Proses transfor-
masi itu dpt dilakukan secara in vitro ?the
transforming principle 1944 Avery, McLeod
McCarty the transforming principle merupakan
senyawa as. nukleat tipe deoksiribose
? sifat genetik ditentukan DNA. 1953 Avery
Crick struktur 3 dimensi DNA.
Nathan Smith menemukan enzim yg dpt potong DNA
secara spesifik (endonuklease
restriksi) hasilkan DNA spesifik. Enzim DNA
ligase mampu sambung potongan DNA. 1970-an Berg
gunakan enzim DNA restriksi DNA ligase ?
berhasil sambung molekul DNA suatu
virus ? mol. DNA rekombinan. ? mendpt hadiah
Nobel ! Pengembangan teknologi baru
yg disebut teknologi DNA rekombinan ? rekayasa
genetik. Para ahli mampu melakukan
perubahan2 sifat genetik organisme secara ter-
arah (yg diinginkan) ? misalnya tanaman
/ organisme transgenik (GMP / GMO)
Genetically Modified Plants / Genetically
Modified Organisms.
2
MIKROBIOLOGI
BIOLOGI MOLEKULER
BIOKIMIA / KIMIA
GENETIKA REKAYASA KIMIA

ELEKTRONIK ILMU PANGAN

REKAYASA MEKANIK
TEKNOLOGI PANGAN BIOTEKNOLOGI
KOMPUTER BIOTEKNOLOGI PERTANIAN
BIOTEKNOLOGI INDUSTRI
BIOTEKNOLOGI LINGKUNGAN
BIOTEKNOLOGI KESEHATAN Ilmu dasar dan teknologi
yg mendasari perkembangan bioteknologi modern
serta 4 cabang utama bioteknologi. Aplikasi
bioteknologi dlm bidang
Pertanian Kesehatan Industri Lingkungan
Pengembangan tanam- an transgenik Produksi bahan tera- peutik Produksi bahan industri Penanganan limbah
Kandungan provitamin A tinggi Produksi insulin gunakan mikroba Produksi beragam enzim rekombinan Ekstraksi akumulasi logam berat
Toleran thd lingkungan salinitas tinggi Prod. vaksin hepatitis B rekombinan Produksi metabolit pri-mer (mis. As. Amino) Degradasi pestisida senyawa sejenis
3

• Teknologi rekayasa genetika yg diterapkan dalam
  memproduksi komoditi dan pengolahan pangan
  merupakan suatu terobosan ilmiah yg baru,
  khususnya dlm meningkatkan produkti-
• Vitas tanaman dan ternak, meningkatkan mutu gizi,
  mempermudah dan mempermurah biaya produksi dan
  teknologi pengolahannya ? timbul kontroversi.
  Komoditi baru yg dihasilkan
• mengandung gen makhluk lain ? bersifat tdk
  alamiah ? risiko jangka panjang ?? muncullah
• gejolak masyarakat berupa protes dan gugatan thd
  diproduksinya tanaman transgenik.
• Perkembangan bioteknologi yg sedang terjadi
  saat ini awal dari revolusi industri ketiga
  (revolusi industri I dlm bidang energi revolusi
  industri II dlm bidang teknologi informasi).
• Indonesia mega biodiversity ke-2 sesudah Brazil ?
  potensial !!!
• Krismon (1998) ? perlu bangkit! Potensi
  Indonesia di bidang biotek (Zuhal, 2000) a.l.
• 1. teknologi produksi bahan baku obat dan
  diagnostik
• harga obat alat kesehatan naik 200-30
  karena ketergantungan bahan baku impor
• baru tingkat reproduktif, blm berbasis
  hasil riset sendiri ? prioritas aplikasi
  teknologi
• ekstraksi tanaman obat (megadiversitas
  !) partisipasi swasta dlm produksi antibiotika
• (penisilin, tetrasiklin, eritromisin).
• 2. Teknologi produksi pupuk hayati
  (biofertilizer). Subsidi pupuk dihapus ? dilema
  petani
• ? pupuk hayati bakteri bintil akar
  (Rhizo-plus), bakteri pelarut fosfat Pseudomonas
• spp., dan Micrococcus pupuk hayati
  kombinasi Emas (enhancing microbial activities
• in the soils) mengandung Azospirillum
  lipoverum, Azotobacter beijerinckii, Aeromonas
• punctata, dan Aspergillus niger.
• 3. Teknologi bioinsektisida pemanfaatan
  mikroorganisme kapang dan bakteri serta virus
• tertentu utk mngendalikan hama dan
  penyakit pada tanaman ? pengendalian secara

4
K U L T U R I N V I T R O


Pada awalnya
orientasi hanya pd pembuktian teori potensi sel
tumbuhan ? sarana penelitian di bidang fisiologi
dan aspek-aspek biokimia ? industri, koleksi dan
konservasi plasma nutfah (dlm nitrogen cair dg
suhu -196 0C), bioteknologi, dll. ? - Kultur
jaringan hewan - Kultur jaringan tumbuhan ?
sifat totipotensi Penanaman secara aseptik ? -
kultur cair
- kultur padat Syarat yg diperlukan -
laboratorium kultur in vitro
- fahami ilmu-ilmu dasar terkait
sistematika, fisiologi, kimia, fisika,
mikrobiologi, sitologi,
histologi, dll.
- ketrampilan, ketekunan kesabaran tinggi
persiapan media, iso-
lasi bahan, sterilisasi, inokulasi,
kultur, aklimatisasi, dll. Macam kultur a)
kultur organ, culture of isolated plant organs
meristem, shoot tip, bud
culture, root culture, anther culture
b) kultur kalus, culture
of a differentiated tissue from explant allowed
to
dedifferntiate in vitro ? callus tissue
c) kultur suspensi culture of
isolated cells or very small cell aggregates re-
maining
dispersed in liquid medium (? shaker) inisiasi
dr kalus d) kultur
protoplasma sel-sel muda yg diinisiasi dlm media
cair dihilangkan
dinding sel (dg enzim) ? hibridisasi
somatik, fusi 2 protoplasma,
intraspesifik atau interspesifik
e) kultur haploid (kultur
mikrospora / kultur anther
f) kultur embrio culture of isolated mature or
immature embryos.

5
P E N D A H U L U A N

• Bioteknologi
• Penerapan prinsip-prinsip biologi, biokimia,
  dan rekayasa dlm pengolahan bahan
• dengan memanfaatkan jasad hidup atau / dan
  komponen2-nya untuk hasilkan
• suatu produk yg diinginkan ?berkaitan dengan
  reaksi-reaksi biologis.
• Bioteknologi modern teknik manipulasi DNA
  secara in vitro manipulasi genetik.
• Komponen organisme sel, jaringan, organel,
  molekul-molekul tertentu (DNA, RNA, protein,
  enzim).
• 
  
  

Bioteknologi konvensional Bioteknologi modern
1. Relatif murah teknologi relatif sedehana 1. Relatif mahal teknologi canggih
2. Efek jangka panjang umumnya sdh diket. karena sistemnya sudah mapan 2. Pengaruh jangka panjang belum dike- tahui
3. Perubahan sifat genetik tidak terarah 3. Perbaikan sifat genetik terarah
4. Tidak dpt atasi inkompatibilitas genetik 4. Dapat atasi inkompatibilitas
5. Hasil tdk dpt diperkirakan sebelumnya 5. Hasil dapat diperkirakan
6. Butuh relatif lama hasilkan galur baru 6. Dpt hasilkan 7 perpendek waktu
7. Butuh relatif lama hasilkan galur baru 7. Perpendek waktu hasilkan galur baru dgn sifat baru yg tdk ada secara alami
8. Sering tdk dpt atasi kendala alam dalam sistem budidaya tanaman 8. Dpt tingkatkan kualitas atasi kendala alam dlm sistem budidaya tanaman
6


Schematic representation of shoot tip culture
7
Schematic representation of vegetative
propagation by single node technique.
8
(No Transcript)
9
Setiap bahan tanaman memp. tingkat kontaminasi
permukaan yb berbeda, tergantung dari -
jenis tanaman bagian tanaman yg digunakan
- morfologi permukaan (mis. berbulu / tidak)
- lingkungan tumbuh ( rumah kaca / lapangan)
- musim waktu mengambil (musim hujan / kemarau)
- umur tanaman (kecambah / tanaman dewasa)
- kondisi tanaman (sakit / sehat) Sterilisasai
eksplan, umum digunakan NaClO 1, H2O2 10,
alkohol 70 , larutan bromin 1, HgCl2 0,01-1
(sangat toksik !), fungisida (benlate),
antibiotik 4-50 ppm (rifamisin, streptomisin,
carbenisilin). Komposisi media kultur 1) unsur
hara makro dan mikro
2) sumber energi sukrosa, glukosa
3) vitamin
thiamin (B1), piridoksin (B6)
4) ZPT / Growth regulators
auksin (sesuai tipe pertum-
buhan yg dikehendaki, level
auksin endogen), sitokinin
(kinetin, zeatin, BAP), dan
giberelin (utk membantu mor-
fogenesis)

Disamping golongan senyawa organik yg
kandungannya jelas, dlm media kultur sering pula
ditambahkan senyawa kompleks alamiah yg
komposisinya dpt berbeda dari sumber yg satu dg
lainnya,spt air kelapa, ekstrak ragi, ekstrak
pisang, ekstrak kentang, jus tomat, dll.

10
(No Transcript)
11
Karbohidrat sbg sumber energi umumnya digunakan
sukrosa, glukosa, maltosa. Sukrosa dlm media
dihidrolisa jadi monosakharida karena aktifitas
invertase yg terdpt pd dinding sel selama masa
kultur. Hidrolisa sukrosa paling efektif dlm
media dg pH rendah. Sementara itu bahan pemadat
paling banyak digunakan adalah agar
keuntungannya 1. agar membeku pd 45 0C
dan mencair 100 0C ? beku stabil pd kisaran
suhu kultur 2. tidak dicerna enzim tanaman
3. tidak bereaksi dg senyawa-senyawa penyusun
media kultur. Kekerasan media juga dipengaruhi
oleh a. jenis agar yg dipakai tergantung
merk agar ? agar Bacto mahal !!! b. pH
media c. penambahan arang aktif Arang aktif
adalah arang yg sdh dipanaskan bbrp jam gunakan
uap atau udarapanas sifat absorbsi sangat kuat.
Arang aktif dpt ditambahkan ke dlm media pd
berbagai tahap perkem- bangan kultur media
inisiasi, media regenerasi, atau media perakaran.
Pengaruh arang aktif secara umum adalah 1.
mengabsorbsi senyawa-senyawa toksik yg ada dlm
media yg dpt ganggu pertumbuhan kultur,.
2. mengadsorbsi ZPT sehingga cegah pertumbuhan
kalus yg tdk diinginkan ? ingin akar ! 3.
merangsang perakaran dg kurangi tingkat cahaya
sampai ke bag. Yg ada dlm media. Arang aktif
ditambahkan bervariasi 0,2 - 6 (w/v) tergtg
tujuan. Hrs diusahakan agar arang aktif terbagi
merata (homogen) dlm media ? sesdh sterilisasi dg
autoklaf ? botol media se-ring dikocok sampai
agar-agar mulai membeku (cegah arang tidak
mengendap !)
12
Tahapan kerja pembuatan 300 ml medium kultur
13
Langkah-langkah prosedur persiapan (media /
bahan yang akan dikultur), isolasi dan
pe- nanaman serta inkubasi dan penyimpanan kultur
? dibutuhkan 5 ruang - ruang
persiapan - ruang transfer
- ruang kultur - ruang
stok - ruang analisa Teknik
aseptik ? lingkungan kerja, alat-alat media,
serta bahan yg akan dikultur. Media kultur dan
alat paling populer disterilisasi dg cara
sterilisasi uap atau sterilisasi kering. 1)
steam sterilization ? autoclave (suhu berkisar
115 135 0C) umum utk media (121 0C, 15
psi, 20 menit) juga test tube dll. berisi 20
50 ml media Botol
berisi 50 500 ml media ? 25 menit 500 5000
ml media nutrien 35 menit. 2) dry
sterilization ? glassware, metallic instruments ?
sterilisasi 160 180 0C, 3 jam? bungkus
aluminum foil, Autoklaf terkini memp. Program utk
sterilisasi kering dan uap. Utk jumlah
sedikit, bisa gunakan domestic pressure cooker
(presto). 3) filter sterilization ZPt,
asam amino, vitamin ? heat labile ? sterilisasi
dg membran filter umumnya terbuat dr
selulosa asettat dan /atau selulosa nitrat. Dalam
proses sterilisasi tsb. semua partikel,
mikroorganisme virus berukuran gt diameter pore
fil- ter akan terpisah. 4. ultra
violet sterilization ? iradiasi via sinar gamma
jarang digunakan utk media kultur ?
mahal !! Dipakai utk peralatan pre-sterilized
disposable plastic wares media yang
sudah disteril (autoklaf) dituang ke dlm plastik
steril tsb (pengerjaan di dlm LFC). Saat transfer
didlm LFC , teknik aseptik (utk tangan) cuci dg
detergen antibakteri, lalu di- semprot alkohol 70
LFC juga harus disemprot alkohol 70 sebelum
digunakan.

14
Tahapan kerja sterilisasi eksplan di dalam LFC
15


Schematic representation of axillary bud method
of vegetatively propagating plants. a) Rosette
plants b) elongate plants
16


Diagrammatic summary of steps involved in Berman
cell planting technique.
17
Diagrammatic illustration of anther and
microspores culture for production of haploid
plants and diploidization
18
(No Transcript)
19
Replikasi DNA dan ekspresi genetik Replikasi
DNA salah satu tahapan penting dlm pertumbuhan
organisme, proses yg awali pertumbuhan sel (pd
virus, replikasi RNA tahapan replikasinya agak
berbeda). Mekanisme replikakasi dilengkapi sistem
editing (penyuntingan yg sangat akurat bahan
genetik yg di- tu-runkan kpd progeny / sel anakan
akan memp. komposisi yg sangat identik dg sel
induk ? duplikat hasil replikasi ? proses
kompleks libatkan banyak protein dg peran
spesifik, dikode gen-gen yg terdpt dlm DNA itu
sendiri ? kaitan fungsional yg amat erat tak
terpisahkan antara replikasi dg ekspresi genetik
dan metabolisme sel secara keseluruhan. Replikasi
bahan genetik proses pengkopian rangkaian mol.
bahan genetik (DNA /RNA) pada virus replikasi
bahan genetik terjadi dlm sel inang.
Model replikasi DNA ? 3 hipotesis
1. semi konservatif setiap molekul untai-ganda
DNA anakan terdiri dari 1 untai-tunggal
DNA induk dan 1 untai-tunggal DNA hasil sintesis
baru. 2. konservatif molekul DNA
untai-ganda induk akan tetap bergabung sedangkan
kedua untaian DNA anakan terdiri dari molekul
hasil sintesis baru. 3. dispersif molekul
DNA induk akan mengalami fragmentasii ? DNA
anakan akan terdiri dari campuran molekul lama
(berasal dari DNA induk) dan molekul hasil
sintesis baru. Messelon Stahl
(1958) buktikan bhw replikasi DNA ? semi
konservatif Escheria coli). tapi pd virus
tertentu dg genom berupa DNA untai-tunggal
Mekanisme dasar replikasi DNA Semi
konservatif ? DNA anakan pasangan untaian DNA
induk untaian DNA hasil sin- tesis baru ?
untaian DNA induk berperan sbg cetakan /
templatebagi pembentukan untaian baru. Molekul
untai ganda terdiri dai 2 untai mol.DNA yg
berpasangan secara komplementer antara basa
nukleotida A-T dan C-G, perlu pemutusan/denaturasi
ikatan komplementer tsb,
20

• masing-masing untaian DNA dpt bertindak sbg
  cetakan setelah denaturasi (enzimatis).
• Denaturasi secara parsial bertahap, diwali
  pd ori (origin of replication/ttk awal replikasi)
  ?ikatan H antara A-T dan C-G terputus diikuti
  pembukaan untaian DNA ? garpu replikasi
• membuka bertahap ? terpisah satu sama lain
  masing-masing sbg cetakan utk penempel-an
  nukleotida-nukleotida penyusun DNA baru, yg
  dipolemerisasi jadi untaian DNA baru , urutan
  sesuai urutan cetakan DNA komplementernya (basa
  nukleotida A akan dipasangkan dg T yg ada pd
  cetakannya, basa C dg G. Untaian DNA yg baru
  terbtk merupakan komple-
• men untaian DNA induk. Proses polimerisasi
  nukleotida terjadi pd kedua untaian DNA ce-
• takan ? akhir 1x putaran replikasi dihasilkan 2
  mol. DNA baru yg identik ? dst. Berulang.
• Komponen-komponen penting dlm replikasi
• a) DNA cetakan mol.DNA atau RNA yg akan
  direplikasi.
• b) mol. nukleotida dATP, dTTP, dCTP, dGTP (3
  komponen nukleotida basa purin atau
• pirimidin, deoksiribosa, dan gugus
  fosfat).
• c) DNA polimerase, mengkatalisis polimerisasi
  nukleotida ? untaian DNA.
• d) Primase, mengkatalisis sintesis primer utk
  memulai replikasi (pd E. coli disbt primosom)
• e) helikase, enzim pembuka ikatan untaian DNA
  induk, dibantu enzim girase.
• f) SSB (sngle strand binding protein),
  menstabilkan untaian DNA yg sudah terbuka.
• g) DNA ligase, enzim penyambung fragmen-fragmen
  DNA.
• Tahapan dlm replikasi DNA
• a) denaturasi (pemisahan) untaian DNA induk
• b) inisiasi sintesis DNA

21
Kedua untaian induk DNA terpisah (enzim
helikase) ? garpu replikasi
sbg cetakan utk sintesis DNA baru
membuka bertahap dari ori
orientasi 5 -P ? 3' OH ? arah
geometris berlawanan Sintesis - searah
pembukaan garpu replikasi (kontinu) ?untaian DNA
awal / leading strand ? DNA baru
merupakan 1 unit. - berlawanan arah
dg pembukaan garpu replikasi (sintesis
diskontinu) ? untaian DNA lambat
polimerisasi fragmen demi fragmen (fragmen
Okazaki) ?disambung enzim DNA
ligase ? unit utuh. Utk memulai replikasi DNA
dibutuhkan - molekul primer, utk awali
proses polimerisasi untaianDNA DNA, RNA, atau
mol.protein spesifik proses polimerisasi
untaian RNA (transkripsi) tdk memerlukan primer ?
fungsi primer sediakan ujung 3'-OH utk
tempelkan mol.DNA pertama dlm proses tsb. -
cetakan / template untaian DNA atau RNA Setelah
nempel pd cetakan ? sintesis DNA baru. Pd
sintesis untaian DNA lambat, perlu gt1 primer krn
sintesis DNA berlawanan dg arah pembukaan garpu
(sintesis diskontinu). Sumber energi utk
aktivitas DNA ligase didpt dari NAD atau ATP. Pd
sintesis untaian DNA awal, arah sintesis searah
pembukaan garpureplikkasi ? berlang-sung kontinu
? hanya perlu 1 mol. primer yaitu pd ttk awal
replikasi. Untaian DNA baru akan disintesis dg
adanya aktivitas DNA polimerase III tanpa
pembtkan fragmen Okazaki. Pd E. coli - DNA
polimerase I mengisi celah antara fragmen Okazaki
reparasi DNA rusak - DNA
polimerase II juga terlibat dlm reparasi DNA
rusak - DNA polimerase III,
proses polimerisasi primer
22
Ekspresi genetik Dlm genom organisme terdpt
rangkaian gen, susun genotip organisme itu ?
diekspresikan dlm bentuk fenotipe - kemampuan
hasilkan metabolit tertentu
- kemampuan
thd hama / penyakit
- toleransi thd faktor
lingkungan tertentu
- rasa buah, btk
warna daun, batang, dll. Ekspresi genetik
dilakukan melalui proses transkripsi gen-gen
tertentu menjadi RNA (mRNA, rRNA, tRNA)
selanjutnya mRNA alami translasi ? protein /
enzim. Transkripsi proses penyalinan kode-kode
genetik pd urutan DNA ? mol.RNA
proses ini mengawali ekspresi sifat2 genetik
(ciri fenotipe). Translasi memerlukan mol. rRNA
utk susun ribosom dan tRNA bawa as. amino
spesifik yg akan dirangkai ? mol.
protein. Transkripsi dan translasi 2 proses
berbeda yg saling berkaitan erat sangat
me- nentukan kemampuan organisme utk tumbuh
berkembang. Proses transkripsi dilakukan RNA
polimerase pd prokariota hanya ada 1 macam RNA
polimerase pd eukariota ada 3 - RNA
polimerase I, menyalin gen yg mengkode rRNA
- RNA polimerase II, menyalin semua gen
pengkode protein - RNA polimerase III,
menyalin gen yg mengkode tRNA Pemunculan
fenotipe ditentukan tiga macam molekul RNA tsb.
Proses transkripsi melibatkan bbrp komponen utama
yaitu - urutan DNA yg akan ditranskripsi

- enzim RNA polimerase
-
faktor-faktor transkripsi
-
prekursor utk sintesis RNA
23
Urutan DNA yg akan ditranskripsi adalah gen yg
akan diekspresikan gen merupakan suatu urutan
DNA yg mengkode urutan lengkap as.amino suatu
polipeptida atau mol.RNA tertentu. Gen yg lengkap
terdiri dari 3 bag.utama - promoter, daerah
pengendali / regulatory region transkripsi ,
terletak pd ujung 5' - bag. struktural,
dihilir/downstream promoter mengandung urutan
DNA spesifik (kode-kode genetik) yg akan
ditranskripsi. - terminator di
hilir bag. struktural peran dlm pengakhiran
(terminasi) proses transkripsi. Mekanisme dasar
sintesis RNA (transkripsi) prokariota
eukariota - prekursor utk sintesis RNA 4
macam ribonukleotida yaitu 5-trifosfat ATP, GTP,
CTP, dan UTP (pd RNA tdk ada thymine)
- reaksi polimerisasi RNA pd prinsipnya
polimerisasi DNA, yaitu dg arah 5' ? 3'. -
urutan nukleotida RNA hasil sintesisditentukan
oleh cetakannya yaitu urutan DNA yg di-
transkripsi nukleotida RNA yg digabungkan yg
komplementer dg cetakannya. - mol. DNA yg
ditranskripsi adalah mol.untai-ganda, tetapi yg
berperan sbg cetakan hanya salah satu
untaiannya. Perbedaan struktural sel prokariota
eukariota ? beda struktur gen, faktor pengendali,
meka-nisme sistem regulasi . Pd prokariota,
seblm transkripsi selesai dilakukan, sdh diikuti
proses translasi. Pd eukariota, proses
transkripsi terjadi di dlm nukleus translasi pd
sitoplasma ? translasi baru dilaksanakan bila
proses transkripsi sudah selesai. Organisasi
gen pd prokariota Umumnya gen yg mengkode
protein pd prokariota gen dg kopi tnggal /
single copy, gen yg mengkode tRNA cRNA gen dg
jumlah kopi banyak / multiple copies.Gen-gen yg
bertang-gung jawab dlm jalur biokimia tertentu
umumnya diorganisasikan dlm btk operon
(organisasi bbrp gen struktural yg ekspresinya
dikontrol 1 promoter yg sama) ? mis. operon
lac.
24
Operon lac (kendalikan potensi metabolisme
laktosa pd E. coli)terdpt 3 macam gen struktural
yg kode protein berbeda - gen Z, mengkode
ß-galaktosidase
- gen Y, mengkode permease
- gen A mengkode
trans-asetilase masing-masing memp. kodon
inisiasi/awal kodon terminasi, tapi ekspresinya
dikontrol oleh 1 promoter yg sama ? transkripsi
akan hasilkan 1 mRNA yg bawa kode-kode genetik
bagi ketiga macam polipeptida tsb (? disebut
mRNA polisistronik). Organisasi gen pd
eukariota Pd eukariota, ekspresi 1 gen
struktural yg kode suatu protein dikontrol 1
promoter spesifik ? yg dihasilkan mRNA
monosistronik ( utk 1 macam protein saja). Konsep
Beadle Tatum (1941) teori satu gen satu
enzim tapi banyak protein / enzim yg mol.
Lengkap semua polipeptidanya dpt dikode oleh gt1
gen struktural.(mis. mol.hemoglobin dikode oleh 2
gen) ? sekarang dikenal teori satu gen satu
polipeptida. Seringkali pd banyak gen eukariota
terdpt urutan2 nukleotida (kodon) yg tdk
diketemukan terjemahnnya dlm urutan as.amino
(intron / intervening sequencs) pd
awalnyaditranskripsi, tapi selanjutnya mengalami
pemotongan ? transkrip mRNA tdk mengandung urutan
tsb bag. yg hilang dari mRNA itu tdk akan
ditranslasi jadi urutan as.amino.Sebaliknya, bag.
gen struk- tural yg ditranskripsi jadi mRNA dan
lalu ditranslasi disebut exon. Setelah pemotongan
intron, exon-exon disambung (splicing)? mRNA
(tanpa intron), translasi jadi urutan asam2
amino. Translasi (hanya mRNA yg ditranslasi !)
berlangsung dlm ribosom diperlukan mol.tRNA utk
bawa as.amino spesifik (ada 20 macam tRNA ? 20
macam as.amino yg susun protein alami)
Transposisi suatu proses perpindahan elemen
genetik dari 1 lokus dlm 1 kromosom, plasmid,
atau genom virus, ke bag. lain kromosom yg sama,
atau ke suatu lokus kromosom lainnya.
25
Transposisi suatu proses perpindahan elemen
genetik dari 1 lokus dlm 1 kromosom, plasmid,
atau genom virus, ke bag. lain kromosom yg sama,
atau ke suatu lokus kromosom lainnya. Elemen
genetik yg berpindah mungkin 1 atau beberapa gen
yg bertaut (linkage) ? elemen genetik yg dpt
berpindah (transposablegenetic elements) atau
transposon ? prokariota, eukariota, maupun
bakteriofag. Dlm prokariota (E. coli) diketahui
3 kelompok transposon 1. sekuen penyisip /
insertion sequences suatu urutan nukleotida yg
hanya berfungsi utk transposisi
sekuen saja ? transposon paling sederhana. 2.
elemen penyisip / insertion elements ntransposon
yg berfungsi transposisi dan memba-
wa gen lain mis. Gen ketahanan thd antibiotik
disebut juga transposon komposit. 3.
bakteriofag Mu bakteiofag lisogenik yg gunakan
proses transposisi sbg cara hidupnya. Transposon
dlm eukariota 1. elemen Ty dlm khamir ?
Saccharomyces cerevisiae 2. elemen copia pd
Drosophila ada juga copia-like element ( 5-10
genom Drosophila mengandung 40 familia
transposon mirip elemen komposit. Mekanisme
transposisi belum jelas. Pada E. coli,
transposisi terjadi melalui 1. cara
replikatif ? dibtk duplikat transposon ? akhir
transposisi dihasilkan 1 duplikat
transposon pd tempat yg baru dan satu pd tempat
lama. 2. cara konservatif ? tdk ada
replikasi hanya pemotongan elemen transposon ?
diin- tegrasikan ke tempat
baru.
26

• BIOTEKNOLOGI MIKROBA
• Mikroba - eukariot ? Saccharomyces cerevisiae
• - prokariota ? - Eubacteria
• - Archaea
• ? Berbagai produk gunakan mikroba utk
  dikonsumsi, pupuk / pestida hayati, farmasi, dll.
• Prinsip dasar kultivasi, digunakan
• - medium padat / solid medium ? tempe,
  oncom
• - medium cair / liquid medium ?
  antibiotik, asam-asam amino
• Berdasarkan komposisi medium
  
• - medium lengkap bahan organik,
  ekstrak bahan alamiah (khamir, daging) bahan
• anorganik ? mikroba tumbuh optimal
• - medium minimal defined medium bahan
  kimia sintetis ? pertumbuhan minimal lebih
• ke arah analisis fisiologis / genetika
  yg butuh komposisi nutrisi spesifik (utk hasilkan
• produk tertentu).
• Dalam industri bioteknologi, medium lengkap
  sering komponen tambahan ? berpengaruh
• signifikan thd jumlah produk ? biotin utk
  memacu produksi antibiotik atau as.amino.
• Teknik kultivasi mikroba
• Kultur batch (sekali panen) ? mikroba
  ditumbuhkan dlm medium ? pertumb. maksimal
• ? panen produknya (sel/biomassa atau produk
  metabolitnya) ? kultivasi awal lagi.

27
2) Kultur kontinyu mikroba ditumbuhkan secara
terus menerus pd fase paling optimum fase
pertumbuhan (fase eksponensial) ? beri nutrien
terus menerus secara kemostat (melalui
tanki) ? komposisi nutrien dlm fermentor tetap
(atur aliran medium baru) atau turbidostat,
penambahan nutrien secara kontinyu ? kerapatan
sel (turbiditas kultur) selalu dlm keada-
an tetap. Aliran medium diatur berdasarkan
kerapatan optik kultur media. Bila produk
metabolit berpengaruh negatif thd pertumbuhan
mikroba (protein rekombinan, yg gen-nya dari
jasad lain) ? gunakan kultur batch. Bila produksi
metabolit sel tdk berpengaruh thd pertumbuhan
selnya ? gunakan kultur kontinyu (mis. produksi
protein / enzim homolog, protein yg disintesis
berdasarkan hasil ekspresi gen alami yg dimiliki
jasad tsb. ? skala besar. Mikroba juga dpt
dimanfaatkan hasilkan produk tertentu dg gunakan
medium padat/semipadat ? tempe, tape, jamur
merang, dll. Pemanfaatan dlm bioteknologi
? teknologi DNA rekombinan ? punya kemampuan
fisiolo-gis yg tdk didpt di alam ? bakteri /
khamir hasilkan protein yg secara alami hanya
dihasilkan jasad tingkat tinggi mis. Insulin,
hormon pertumbuhanl. Bbrp produksi yg dimaksud
meliputi 1) produksi pangan yg
dikonsumsi langsung 2) produksi bahan
bakuutk pangan 3) produksi utk dukung
tahapan seblmpanen (pre-harvest materials)
4) produksi bahan-bahan utk pengelolaan
kesehatan 5) produksi bahan-bahan pendukung
industri yg lain Mikroba digunakan sbg. -
agensia produksi kemampuan mikroba dimanfaatkan
utk lakukan
perubahan (biotransformasi) suatu bahan yg
diinginkan ? pd tahap
akhir, sel mikroba dipisah, produk
biotransformasi dipanen.
- produk hasil akhir sel mikroba
itu yg dipanen dimanfaatkan
28

• Agensia produk akhir meliputi
• - produk minuman / beverages bir, wine
  ? khamir
• - produk pangan starter dlm industri
  keju Streptococcus, Lactobacillus
• - asam-asam amino L-asam glutamat,
  phenilalanin, lisin, triptophan
• - asam-asam organik as.fumarat, sitrat,
  laktat, piruvat
• Terkadang agensia produksi sekaligus sbg
  produk akhir ? Industri susu fermentasi.
• Protein yg gennya berasal dari organisme
  tingkat tinggi (mis.insulin), dg gunakan mikrob
• rekombinan ? ekonomis (alami dari
  pankreas sapi / babi) ? mahal !
• b) Produk akhir - dikonsumsi langsung bersama
  substrat tempe, tape, protein sel tunggal /
• single cell protein, (susu mikroba ?
  berguna utk pencernaan).
• Mikroba juga dimanfaatkan pd tahapan
  seblm panen / pre-harvest (utk pupuk / pestisi-
• da hayati) kerapatan sel tertentu ?
  dipanen kemas dlm carrier tertentu mis. tanah
• gambut. Biasanya campuran bbrp jenis
  mikroba atau strain berbeda.
• Peningkatan kemampuan fisiologis mikroba ? 2
  metoda konvensional modern (? tek-
• nik mutagenesis, dg mutagen kimia atau mutagen
  fisik dan fusi prtoplasma).
• 1) mutagenesis dg mutagen kimia ubah karakter
  mikroba dg ubah urutan nukleotida suatu
• gen, meskipun tdk dpt diarahkan secara
  spesifik ? acak. Agensia kimia yg digunakan
• a) analog basa dan b) mutagen kimia

29
2) Mutagenesis dg mutagen fisik ? sinar
ultraviolet dan radiasi ionisasi ? distorsi pd
struk- tur DNA ? hambat proses replikasi DNA
? replikasi tdk sempurna ? komposisi genetik
berbeda dari induknya. 3) Mutagenesis secara
terarah (Site-directed mutagenesis).
Melibatkan teknik kloning DNA a) klon
fragmen DNA yg akan dimutasi ke dlm suatu plasmid
? manipulasi thd fragmen tsb dg
delesi pemotongan dilakukan enzim restriksi
tertentu ? ligasi kembali b) sisipkan
bbrp nukleotida baru. Fragmen DNA dipotong dg
enzim restriksi yg hasilkan ujung
kohesif (mis. EcoRI) ? perlakuan reparasi DNA
secara enzimatis (mis.T4 DNA
polimerase) ? dihasilkan ujung-ujung fragmen DNA
yg pepat (blunt-end) yg mengan- dung
tambahan bbrp nukleotida baru ? ligasi kembali ?
akhirnya diperoleh fragmen DNA baru yg
mengandung sisipan nukleotida baru. c)
diarahkan oleh oligonukleotida tertentu
(oligonucleotide-directed mutagenesisi) me-
rupakan metode paling spesifik dpt
digunakan utk ubah 1 basa tunggal. Fragmen
DNA yg akan dimutasi diklon kedlm vektor DNA
untai-tunggal. Digunakan oligonuk-
leotida tertentuu (panjang 7-20 nukleotida) yg
komplementerdg bag,tertentu fragmen
DNA yg akan dimutasi. Oligonukleotida itu
dirancang memp.1 basa yg tdk dpt berpa-
sangan dg basa yg ada pd lpd fragmen DNA, yaitu
basa yg akan dimutasi ? campur dg
DNA vektor ? terjadi hibridisasi oligonukleotida
pd bag.yg kpmplementer ? sin- tesis
DNA dg gunakan oligonukleotida yg
dihibridisasikan tsb sbg primer. Hasil sinte-
sis berupa mol.DNA untai-ganda ?
transfeksi kedlmsel inang yg sesuai (E. coli) ?
didpt 2 hasil koloni yg bawa mol.DNA
tipe alami yg bawa DNA mutan ? isolasi
kedua DNA ? hibridisasi dg oligonukleotida
pelacak (probe) yg mengandung basa
mutan yg sdh dilabel senyawa radioaktif yg hanya
akan berhibridisasi dg mol.DNA
mutan ?dpt ditentukan koloni yg bawa fragmen gen
mutasi. Utk konfirmasi ? laku- kan
sekuensing DNA dari DNA isolasi yg diduga bawa
gen mutan.

30
Bbrp gen mamalia dan virus yg sdh diekspresikan
pd bakteri utk keperluan medis Protein

Fungsi interferon
agensia antivirus
insulin
terapi diabetes hormon
tumbuh
terapi abnormalitas pertumbuhan hormon
parathyroid
regulasi kalsium virus manusia (hepatitisB,
influenza, AIDS) vaksin virus hewan
(penyakit mulut dan kuku) vaksin
serum albumin
aplikasi transfusi Bbrp antibiotik yg
dihasilkan mikroba Antibiotik
Mikroba terkait penisilin
Pennicillium chrysogenum erythromycin
Streptomyces erythreus kanamycin
Streptomyces kanamyceticus
streptomycin Streptomyces griseus
tetracyclin Streptomyces
rimosus Bbrp vitamin dan asam amino yg
dihasilkan mikroba Metabolit Bahan
pangan Kegunaan Mikroba
terkait glutamat (MSG) berbagai produk
penyedap rasa Brevibacterium


thiogenetalis lysine roti
as.amino esensial B.
flavum tryptophan berbagai produk
suplemen makanan, Corynebacterium

komponen transfusi glutamicum
31
BIOTEKNOLOGI PUPUK HAYATI

Pupuk buatan
artificial chemicall fertilizer urea, TSP
dll.,butuh energi banyak dampak lingkungan.
Pupuk hayati / biofertilizer inokulan mikroba ?
alami ramah lingkungan penambat nitrogen
pelarut fosfat. N2 udara, melalui rangkaian
reaksi diazotrofi (penambatan nitrogen secara
biologis) ? senyawa nitrogen yg siap diab- sorb
tanaman. Fiksasi N 1) secara non-simbiotis ?
free-living microbes kelompok bakteri alga
biru hijau. Bakteri penambat N secara
non-simbiotis dapat bersifat -
aerob Azotobacter, Azospirillum, Derxia,
Mycobacterium, Azomonas. - anaerob
Clostridium, Desulfovibrio, Chlorobium,
Chromatium - fakultatif anaerob
Rhodopseudomonas, Bacillus, Enterobacter.
Dari kelompok sianobakteria Anabaena,
Anabaenopsis, Lyngbya, Oscillatoria,
Nostoc, Calothrix, Plectonema, Stegonema.
Azotobacter heterotrofik (energi dari sisa-sisa
tanaman) ? banyak dipelajari. sifatnya -
laju respirasi paling tinggi
- sifat mesofilik, tumbuh pd suhu sekitar 30 oC
- kerapatan di dlm tanah
103 106 sel / g tanah A. paspali
diestimasi memp. kemampuan sumbang 15-93 kg
N/ha/thn pd dae- rah perakaran Paspalum
notatum. Beijerinckia (di tanah masam tropis)
mampu hasilkan 50 kg N/ha/thn pd
perakaran tanaman tebu. Derxia (pd pH 5,0
9,0). Dlm kondisi tergenamg, Clostridium
acetobutylicum dan C. pasteurianum, jum-
lah meningkat 102 ? 106 sel/g tanah.
Sianobakteri umum di daerah penanaman padi __gt
membtk heterokist / tidak
32
? fiksasi N, dan juga sekresikan vit.B12, auksin,
as. askorbat ? utk pertumb. tanaman. Fiksasi
N secara non-simbiotis N2 (oleh nitrogenase) ?
NH3. Kompleks nitrogenase ter- susun atas 2
metalloprotein - protein molybdo-ferro
(protein Mo-Fe) peran sbg nitrogenase -
protein ferro (protein Fe), peran sbg nitrogenase
reduktase ? dinon-aktifkan oleh keberadaan
oksigen (sifat mutlak anaerob!). Pd
sianobakteri - fiksasi N dlm hetercyst
ddgnya mengandung seny.glikolipid yg dpt menambat
O2 ? suasana anaerob. - tanpa
hetercyst (Lyngbya, Oscillatoria) ? fiksasai N
dlm sel yg terkondisi tereduksi. Pd mikroba
non-simbiotik proses fiksasi N dilakukan dg
adanya laju respirasi yg tinggi ? O2 tdk dpt
capai kompleks nitrogenase. 2) secara
simbiotis Bbrp mikroba lakukan penambatan N
melalui hub. simbiotik dg tan.tertentu ?
struktur khusus pd tanaman ? hub.simbiotik
Rhizobium dg tanaman legum. Rhizobium
bakteri Gram negatif, bersifat aerob, tdk membtk
spora, btk batang dg ukuran (0,5 0,9) x
(1,2 3) µm terdpt dlm daerah perakaran,
simbiosis dg tan.legum khusus. ? 4
kelompok bakteri pembtk bintil akar -
Genus I Rhizobium tumbuh cepat/fast growing
bacteria R. leguminosorum, R.meliloti -
Genus II Bradyrhizobium tumbuh lambat/slow
growing bacteria B. japonicum. - Genus
III Sinorhizobium tumbuh lebih cepat Rhizobium
fredii simbiosis dg kedelai. - Genus IV
Azorhizobium membtk bintil batang pd Sesbania
A. caulinodans. Frankia (Actinomycetes) simbiosis
dg Alnus, Myrica, Casuarina membtk bintil akar
tipe corra- loid (bercabang-cabang) tipe
Casuarina, apeks bintil akar membtk akar
geotropik.
33
Simbiosis Rhizobium - legum dicirikan
pembtkan bintil akar pd tan.legum (inang)
diawali dg sekresi produk metabolisme
tan. ke daerah perakaran ? stimulasi
pertumbuhan bakteri tdk hanya Rhizobium.Tahapan
pembtkan bintil akar umumnya 1) Pengenalan
pasangan yg sesuai antara tanaman-bakteri ?
pelekatan bakteri Rhizobium pd permukaan
rambut akkar tanaman. 2) Invasi bakteri ke dlm
rambut akar melalui pembtkan benang infeksi /
infection thread. 3) Perjalanan bakteri ke akar
utama melalui benang infeksi. 4) Pembtkan
sel-sel bakteri yg alami deformasi (bakteroid),
di dlm sel akar tanaman. 5) Pembelahan sel
tanaman dan bakteri ? terbtk bintil
akar. Pelekatan Rhizobium pd rambut akar dpt
terjadi karena pd permukaan bakteri itu terdpt
suatu protein pelekat rhicadhesin (protein
pengikat kalsium yg berfungsi dlm pengikatan
kompleks Ca pd permukaan akar) dan lectin /
phytoagglutinin (protein berkarbohidrat, berperan
dlm pengikatan bakteri. Penetrasi awal ke
rambut akar dilakukan melalui ujung rambut akar ?
rambut akar meng- gulung akibat sekresi bakteri
(seny.faktor Nod) ?masuk rambut akar ? induksi
pembtkan be- nang infeksi (tabung selulosa)?
bakteri dlm benang infeksi tumbuh ke arah sel-sel
akar ? faktor Nod (dihasilkan bakteri) stimulasi
pembelahan sel-sel tanaman ? bintil akar.
Selanjut- nya bakteri tumbuh cepat dan alami
perubahan bentuk jadi bakteroid (struktur
bercabang), di- kelilingi peribakteroid (membran
sel tanaman) ? barulah terjadi penambatan
nitrogen. Tanaman mati ? bintil akar rusak,
bakteri terlepas keluar sel akar bakteroid tdk
mampu membelah lagi sebagian dorman (yg bukan
bakteroid) ? dpt infeksi akar legum lagi.
Selama pembtkan bintil akar, banyak gen tanaman
Rhizobium yg diekspresikan secara
berurutan. Tahap tertentu ? nodulin (hasil
ekspresi gen tanaman) a) protein yg jaga
struktur bintil akar b) protein yg dukung fungsi
bakteroid (fiksasi N), dan c) protein/enzim yg
diekspresikan selama proses metabolisme dan
asimilasi nitrogen.
34
Perkembangan bintil akar dipengaruhi bbrp faktor


1)
konsentrasi nutrien anorganik 2) suhu tanah
(25 30 0C utk pembtkan bintil optimum, gt /lt
akan terhambat) 3) cahaya naungan (cahaya
tingkatkan jumlah bintil naungan menurunkan)
4) konsentrasi CO2 (konsentrasi tinggi ?
tingkatkan jumlah bintil akar) 5) ketersediaan
N dlm tanah (tinggi ? kurangi jumlah dan berat
bintil akar) 6) keberadaan mikroorganisme
lain di dlm rhizosfer. Mekanisme penambatan N di
dlm bintil akar Bintil akar legum merah
(pigmen leghaemoglobin (LHb) yg mengandung Fe
myoglo-bin pd hewan. hanya pd akar sehat. Yg tdk
sehat, bintil akar putih ? tdk bisa fiksasi N.
LHb berada di luar membran bakteroid, berfungsi
atur konsentrasi oksigen krn bakteroid
bersifat aerob. Fiksasi N sangat peka thd
keberadaan oksigen (gt 0,5 atm hambat fiksasiN krn
terja- di pe-nonaktif-an kompleks nitrogenase.
Dalam hal ini,LHb berfungsi sbg -
fasilitator pengambilan oksigen oleh enzim
oksidase terminal dan tingkatkan produksi
ATP utk aktivitas nitrogenase. - pencipta
suasana anaerob di sekitar nitrogenase (gabung dg
oksigen ? oxyhaemoglo- bin (OLHb) hingga
O2 tersedia di permukaan membran sel bakteri ?
OLHb bantu pro- ses respirasi bakteri
sediakan ATP utk tambat N sekaligus lindungi
kompleks nitroge- nase dari pengaruh
oksigen. Dlm proses penambatan nitrogen -
nitrogenase reduktase (protein Fe) berinteraksi
dg ATP dan Mg - nitrogenase (protein Mo-Fe)
mengkatalisis reduksi N2, H, asetilen ?gt NH3, H2
, etilen. Selama fiksasi N, sumber reduktan utk
transfer elektron berasal dr ferredoxin /
flavodoxin yg tereduksi ? berikan elektron ke
protein Fe hingga reduksi protein Mo-Fe, diikuti
pelepas-an P anorganik kompleks nitrogenase
peroleh energi dari ATP hasil respirasi ? protein
Mo-Fe berikan elektron ke substrat yg dpt
direduksi, misalnya N2.
35
Secara umum reaksi fiksasi N pd bintil akar

N2 16 ATP 8e-
10 H 2 NH4 H2 16 ADP
16Pi
Mg Amonia adalah produk stabil I
pd proses fiksasi N ? ditransfer melalui membran
bakteroid ke del tanaman ? digunakan dlm
metabolisme tanaman. Sianobakteri yg
membentuk asosiasi simbiotik, yg memp. Heterocyst
yaitu Anabaena azo-llae bersimbiosis dg Azolla
(Pteridophyta). Anabaena berasosiai dg rambut
multiselular dlm rongga khusus daun Azolla
berperan dlm transfer N dari mikrosimbion dan
tan.inangnya. Pe- nambatan N terjadi dlm
heterocyst. Azolla banyak digunakan sbg pupuk
hijau pd petanaman padi.A. filiculioides mampu
tumbuh lebih cepat 50 hari dpt hasilkan biomassa
1700 kg b.k./ha ?yg mengandung nitrogen 52 kg
N/ha. Azolla mudah terkomposisi menjadi ammonia ?
potensi sediakan unsur N yg dibutuhkan tanaman
padi. Mikroba pelarut fosfat ?mampu lakukan
pelarutan (solubilization) fosfat dari sumber
fos-fat (batuan fosfat) bakteri ( Pseudomonas,
Bacillus) dan jamur (Penicillium, Aspergillus).
Ke- mampuan larutkan fosfat krn sekresikan
as.organik format, asetat, propionat, laktat,
glikolat, fumarat, dan suksinat ? pH tanah turun
? fosfat larut? as. hidroksi meng-chelate Ca Fe
? pelarutan dan penggunaan fosfat lebih efektif.
Ca3(PO4)2 ? H2(PO4)- dan H(PO4) sbg hara P yg
tersedia bagi tanaman. Jumlah fosfat terlarut yg
dihasilkan mikroba heterotrof ber- Variasi dg
banyaknya karbohidrat yg dioksidasi dan
transformasi itu umumnya terjadi bila substrat
berkarbon diubah jadi as,organik. As.nitrat
sulfat yg dihasilkan dlm oksidasi bahan nitrogen
atau seny,anorganik sulfur bereaksi dg batuan
fosfat hingga tingkatkan jumlah fosfat terlarut.

36
Teknik dasar pembuatan pupuk hayati ? dibutuhkan
4 komponen

a) mikroba yg sesuai utk suatu jenis pupuk hayati
? bila gt 1 mikroba, hati-hati ! b) medium
utk perbanyakan sel mikroba yg akan digunakan
c) bahan pembawa / carriermikroba d) bahan
pengemas / packaging materials Bila gt 1 mikroba
(beda strain, spesies, atau genus) ? lakukan uji
antagonistik ! ? setiap macam mikroba kultur
dulu terpisah dlm medium yg paling sesuai
sebelum dikemas. Secara umum, tahap produksi
inokulan mencakup 1) isolasi dan skrining
mikroba yg akan digunakan sbg pupuk 2)
perbanyakan mikroba dlm medium yg tepat 3)
pencampuran dg bahan pembawa / carrier 4)
pengemasan Idealnya, mikroba diisolasi dari
habitat lokal ? adaptasi mudah pd lingkungan
tem- pat aplikasi. Menurut Keyer dkk. (1993)
inokulan Rhizobium tsb. sebaiknya 1)
mampu membtk bintil akar menambat N pd tan.
legum targetnya 2) mampu infeksi membtk
bintil akar meskipun ada rhizobial pesaing
3) mampu menambat N dlm kisaran kondisi
lingkungan yg luas 4) mampu btk bintikl
akar menambat N meski ada N di dlm rtanah
5) tumbuh baik dlm medium perbanyakan, dlm
carrier, dan dlm tanah 6) persisten di dlm
tanah, khususnya utk kepeluan penanaman kembali
7) mampu bermigrasi dari ttk awal
inokulasi 8) mampu mengkolonisasi tanah
tanpa ada pengaruh akar tan.inang 9)
toleran thd cekaman lingkungan 10) mampu
dukung fiksasi N dlm asosiasinya dg kisaran
kultivar tan. yg luas 11) sesuai /
kompatibel dg bahan kimia yg digunakan dlm
pertanian
37
Medium kultur utk Rhizobium ? YEMA ( Yeast
Extract Manitol Agar) perlu subkultur
! Komposisi YEMA (manitol bisa diganti sukrosa
atau glukosa) Komponen
Berat /L (g) K2HPO4
0,5

MgSO4 0,2
NaCl
0,1 Manitol
10,0
Yeast extract
1,0
Akuades 1000
Agar
20 Perbanyakan dilakukan dlm fermentor
besar dilengkapi alat atur pH, oksigen terlarut,
suhu dan penggojlok atau tabung erlenmeyer dg
shaker yg diatur kecepatannya. Carrier yg
digunakan dlm pembuatan pupuk hayati sebaiknya
bersifat 1) memp. Kkemampuan tinggi dlm
menahan air 2) tdk toksik bagi mikroba
3) mendukung pertumbuhan mikroba 4) secara
umum steril atau sdh disterilkan 5) bahan
mudah diperoleh dg harga murah 6) mep.daya
lekat thd benih 7) memp. Komposisi seragam
secara kimia 8) mudah diatur pH-nya 9)
mudah didegradasi, tidak mencemari lingkungan
10) mudah melepaskan mikroba bila digunakan di
tanah 11) mudah dicampur dan dikemas

38
Gambut ideal sbg carrier dpt pula digunakan
lignite, arang, vermiculite, zeolite, dll. Biasa-

nya
ditambahkan pula bahan lain spt kapur dan
lempung, utk atur pH, peroleh tekstur
bahan Inokulan yg baik dan mudah dikemas serta
digunakan ? kemas dlm kantong kuat tapi
lentur tdk mudah sobek atau bocor ? aluminum
foil. Inokulan dicampur benih yg akan ditanam,
bi- asanya dipakai 4-6 g inokulan/kg
benih. Produksi inokulan Azotobacter
Kemampuan fiksasi N Azotobacter 2-15 mgN/gsumber
karbon yg digunakan, sifat hidup bebas, inang tdk
spesifik juga mampu hasilkan metabolit lain yg
bermanfaat bagi pertum- buhan tanaman spt,
auksin, thiamin, riboflavin, pyridoxin,
as.nikotianat, giberelin, dll. Juga hasilkan
antibiotik anti jamur ? baik utk perkecambahan.
Prinsip dasar produksinya Rhizobium.
Perbanyakan dpt dilakukan dg medium cair
dlm fermentor atau dg tabung erlenmeyer. Bahan
pembawa dibuat bubuk dulu, dinetralkan dg CaCO3
dan dicampur dg kultur cair, baru dikemas ?
inokulan berbtk bubur? benih dicam- purkan ?
keringkan dlm kondisi teduh ? tanam. Bila sistem
penanaman melalui benih ? celupkan akar bibit ke
dlm bubur inokulan selama 10-30 menit sebelum
ditanam. Dlm skala kecil ? kultur medium agar ?
kerok dari agar ? suspensikan dlm akuades steril
? lang- sung gunakan sbg inokulum. Sianobakteri
/ blue green algae sbg pupuk hayati Sifat
fotosintetik dan mampu fiksasi N Anabaena,
Anabaenopsis, Nostoc, Stigonema, dll. Juga
sekresikan auksin, vit.B12, dan as. askorbat. ?
tingkatkan pertumbuhan padi. Nitrogen fiksasi
akan dilepas ke lingkungan dlm btk asam-asam
amino, protein, dan ZPT. Utk pertum- buhan alaga
diperlukan cahaya inkubasi bbrp minggu pd 28-32
0C. Koloni alga yg terpisah ? Ambil pindahkan
ke medium padat / cair utk identifikasi atau
simpan sbg kultur stok.
39
Metoda yg paling umum digunakan dlm penyiapan
alga sbg pupuk hayati metoda lubang polythene,
dibuat lubang-lubang kecil di sawah/lapangan
tutup dg lembar polythene tebal. Masukkan
campuran10 kg tanah dan 200 g superfosfat ke dlm
lubang, isi air 10 cm utk atur pH (7)
gunakan kapur. Setelah tanah mengendap ? taburkan
inokulum 100 g ke permukaan air ? sekitar 1
minggu mulai pertumbuhan alga di permukaan air ?
biarkan air mengering ? biomassa alga dikeringkan
? dpt digunakan 1 minggu setelah penanaman padi
dg dosis 10 kg/ha. Penggunaan fungi
vesikular-arbuskular mikoriza (VAM) sbg pupuk
hayati VAM jamur non-patogenik yg
berasosiasi dg kelompok tumb.tertentu. Ada 3
asosiasi mikoriza 1) ektomikoriza, pembtkan
selubung miselium jamur di sekitar akar tumbuhan
2) endomikoriza, jamur invasi ke
dlm akar tumbuhan utk bersimbisis
3) ektendomikoriza, infeksi jamur ektotrofik,
hifa terkumpul di dlm sel korteks. Asosiasi VAM
berperan bantu serap fosfat dari tanah,
meningkatkan pertumbuhan seca- ra signifikan pd
tanah yg kekurangan fosfat jugabantu serap unsur
mikro, tingkatkan ZPT, pembtkan bintil akar,
serta toleransi tanaman thd cekaman kekeringan.
VAM bersifat simbion obligat ? tdk dpt
ditumbuhkan pd medium buatan terpisah dari
tanamannya ? penyiapan inokulum berbeda. VAM dpt
dihasilkan dg gunakan kultur pot. Inokulum
(spora) yg digunakan sbg starterdpt diperoleh
dari tanah dg cara penyaringan ? spora yg
diperoleh sterilkan permukaannya dg chloramin T
dan streptomisin ? cuci air steril.
Penyiapan kultur VAM tanpa tanah akan mengurangi
risiko terbawanya mikroba tanah lainnya yg
merugikan ? misalnya gambut, perlite,
vermicullite, pasir, kulit kayu yg diha- luskan.
Aplikasi mikoriza dilakukan dg menempatkan
inokulum di bawah benih atau bibit seblm ditanam.
Utk tingkatkan keberhasilan, sering VAM
dikombinasi dg inokulum lainnya yg sesuai utk 1
jenis tanaman, mis. Dg Rhizobium.
40
Skema pembuatan inokulum VAM Tanah

Sterilisasi spora VAM
Spora VAM
Pot steril (diisi
pasir dan tanah steril 11)
Tanaman inang ditumbuhkan
pada pot
Bibit ditanam
Dicek keberadaan spora
pada akar Akar
dipotong dan dogunakan sbg inokulum awal
Inokulum awal (starter) dibenamkan di pot dan
benih ditumbuhkan di sekitarnya
Inokulasi pot yg
lebih besar
Bibit diambil setelah 3-4 bulan
Akar dihaluskan
bersama-sama tanahnya
Inokulum VAM siap
41
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

Rekayasa genetik /
genetic engineering / kloning DNA ? teknik
gabungkan molekul-molekul DNA secara in vitro ?
molekuk DNA rekombinan sesuai dg yg diharapkan.
Pemuliaan orga- nisme secara konvensional ?
berlangsung secara in vivo. Skema kloning DNA
A.
isolasi DNA yg akan di klon
B. pemotongan DNA dg endonuklease
restriksi C.
penyambungan DNA - DNA vektor gunakan DNA
ligase D.
tranformasi sel inang dg DNA rekombinan hasil
ligasi E.
analisis konfirmasi DNA rekombinan dlm sel
inang
F. Karakterisasi fungsional gen yg diklon A.
Isolasi DNA Utk sisipkan suatu gen tertentu
ke dlm sel jasad target perlu terlebih dulu
isolasi DNA yg mencakupi gen yg dimaksud ?
dpt dilakukan dg beberapa cara, yaitu 1)
isolasi DNA genom , dilanjutkan dg pemotongan DNA
genom dg endonuklease restriksi 2) isolasi
mRNA yg merupakan hasil transkripsi gen yg
dimaksud ? lanjutkan dg membuat turunan
(complementary DNA / cDNA) 3) sintesis
nukleotida yg susun gen tsb (buat gen sintetik)
dg teknik sintesis kimia 4) lakukan
amplifikasi DNA dg teknik PCR (Polymerase Chain
Reaction)
42
1) Isolasi DNA genom

Prinsipnya
pecah dulu sel dg bbrp agensia, baik secara fisik
maupun kimiawi a) secara fisik gunakan
sonikator, alat yg hasilkan suara dg frekuensi
ultra tinggi. Sel disuspensikan dlm
senyawa buffer ? ujung sonikator masukkan ke dlm
suspensi sel. ? efektif utk pecah sel
bakteri, kurang utk sel eukariota tingkat tinggi
(tanaman) ? ddg sel b) dg gunakan
enzim lisozim yg dpt peceh ddg sel sering
dikombinasi dg perlakuan fisik (mis.
pemanasan) ? lebih mudah pecah c) gunakan
CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) biasanya
utk jar. tanaman Setelah sel pecah ? isolasi
dan pemurnian DNA mis. Dg kit yg terdiri dari
partikel sa- ngat halus yg dpt ikat DNA tapi
tdk ikat molekul lain yg ada dlm sel ? bersikan
genom dari RNA, protein, dan sisa-sisa sel ?
akhirnya isolasi gen secara lebih spesifik.
Utk isolasi fragmen DNA tertentu ? potong DNA
genom - dg enzim endonuklease restriksi
tertentu - dg cara mekanis mis.dg
gunakan sonikator jarang dilakukan (ujung tdk
beraturan) Teknik kloning dg cara isolasi DNA
genom disebut juga sbg kloning secara acak atau
kloning genomik. 2) Isolasi mRNA dan
pembuatan cDNA Dibuat turunan DNA yg
mencakupi suatu gen dg gunakan mRNA ? isolasi
mRNA ? ubah jadi turunan DNA (cDNA) dg
bantuan transkriptase balik (reverse
transcriptase) 3) Pembuatan gen sintetis
Kini banyak metode sintesis nukleotida secara
otomatis atau semi-otomatis. Gen-gen
berukuran besar harus sintesis secara bertahap ?
urutan nukleotidanya dg teknik DNA
sequencing. Mungkin bisa dihasilkan gen baru yg
sama sekali blm pernah ada di alam ? blm
tentu dpt diekspresikan jadi rangkaian as.amino
suatu protein fungsional.
43
4) Amplifikasi DNA dg teknik PCR (Polymerase
Chain Reaction), reaksi berantai polimerase.


Amplifikasi ini dilakukan secara in vitro dg
gunakan a. enzim DNA polimerase umumnya
dari bakteri thermotoleran, enzim Taq DNA
polymerase tahan thd suhu sangat
tinggi (95 100 0C) DNA cetakan hrs
didenaturasi (dipisahkan ikatan
antar untaiannya) dg perlakuan panas. Kini juga
adaTth DNA polymerase dan Pwo DNA
polymerase.
b. dNTP dinukleotida triphosphat dATP,
dTTP, dCTP, dan dGTP sbg bahan dasarutk buat
untaian DNA karena mol.DNA disusun oleh
keemoat nukleotida tsb. c. oligonukleotida
primer, mol.nukleotida berukuran pendek (10-30
basa nukleotida) yg diper- lukan
dlm awali proses sintesis DNA, urutan basa tsb
ditentukan agar dpt nempel (kom-
plementer) pd mol.DNA detakan yg akan disalin /
amplifikasi dpt dibuat sintesis kimiawi. d.
molekul DNA cetakan / DNA template, mol.DNA yg
urutan nukleotidanya akan disalin. DNA
cetakan diisolasi dari sel ? gunakan sbg
cetakan yg akan dibaca oleh enzim DNA poli-
merase utk membuat salinan urutan
nukleotida. Teknik PCR campur keempat komponen
tsb dlm tabung Eppendorf ? masukkan ke dlm
thermo- cycler ( dpt diatur utk buat suatu siklus
perubahan suhu yg diperlukan dlm amplifikasi DNA.
Suhu alat diatur 95-100 0C, 5 menit ? DNA
cetakan alami denaturasi kedua untaiannya
terpisah. Pemisahanuntaian dierlukan agar
oligonukleotida primer dpt nempel (dg untaian
ganda tdk bisa). ? Suhu alat diturunkan sesuai
utk penempelan primer pd DNA cetakan ( 50-60
0C) tepatnya tergtg urutan basa nukleotida
primernya ? naikkan 72 0C utk polimerisasi.
Siklus perbahan suhu berulang-ulang 25-35 kali ?
didpt mol.DNA baru berlipat ganda. B. Pemotongan
DNA dg enzim endonuklease restriksi Enzim
tsb diisolasi terutama dari sel prokariota
diklasifikasi (3 tipe) berdasarkan ttk penge-
nalan ttk potong (recognition site and
restriction site). Hasil pemotongan ujung tumpul
(le- bih sulit disambung lagi
oleh DNA ligase) dan ujung kohesif (sticky ?
mudah disambung).
44
Bila 2 macam DNA yg asalnya beda tapi punya
daerah pengenalan oleh enzim yg sama


dipotong dg enzim restriksi
yg sama kedua
mol.DNA akan memp.ujung-ujung yg komplementer


enzim DNA ligase


DNA rekombinan C. Penyambungan DNA
(ligasi DNA) Mol.DNA yg memp,ujung hasil
pemotongan oleh enzim restriksi yg sama ? mudah
disam- bung oleh DNA ligase ? yg sering
digunakan enzim yg gen-nya berasal dari genom
virus (bakteriofag) T4 ? T4 DNA ligase -
mampu sambung DNA ujung kohesif maupun tumpul

- mampu sambung RNA dan DNA
sedangkan yg dar