ANTIGEN-ANTITELO

1
ANTIGEN-ANTITELO REAKCIJE
2
Plan

• Ag-At reakcije (opšte osobine)
• Imunoaglutinacija
• Imunoprecipitacija
• Ag-At reakcije sa obeleženim reagensima
• Ag-At reakcije zavisne od komplementa

3
Ag-At reakcije su laboratorijske reakcije izmedu
antigena i odgovarajucih specificnih antitela
Ispituje se prisustvo ili antigena (korišcenjem
poznatog antitela) ili antitela (korišcenjem
poznatog antigena) u uzorku (npr. serumu)
Tradicionalno se zovu i serološke reakcije
Mogu da budu
Rezultat
1. Kvalitativne
POZITIVAN
NEGATIVAN
2. Kvantitativne
Ag - KONCENTRACIJA (npr. 2 mg/ml)
At - TITAR (npr. 1/80)
TITAR je mera kolicine specificnih antitela i
predstavlja vrednost (reciprocnu) najveceg
razblaženja seruma koji daje pozitivnu reakciju
4
IMUNOAGLUTINACIJA
5
IMUNOAGLUTINACIJA je reakcija izmedu
korpuskularnog (nerastvorljivog) antigena i
odgovarajucih specificnih antitela
Antigen je najcešce na površini celije (npr.
bakterije) ili je solubilan molekul vezan za
inertnu nesolubilnu cesticu (nosac)
Rezultat reakcije je aglutinat, vidljiva
struktura nastala zgomilavanjem tj.
aglutinacijom cestica
Optimalno stvaranje aglutinata javlja se u zoni
ostvarivanja ekvivalentnog odnosa izmedu
antitela i antigena
6
EKVIVALENTAN (OPTIMALAN) ODNOS
VIŠAK ANTIGENA
VIŠAK ANTITELA
Ag-At KOMPLEKSI AGLUTINACIJA REZULTAT
MALI NE POSTOJI NEPOUZDAN (LAŽNO
NEGATIVAN) FENOMEN PROZONE
VELIKI POSTOJI POUZDAN (POZITIVAN)
MALI NE POSTOJI NEPOUZDAN (LAŽNO NEGATIVAN)
7
Primena (Primer)
Krajnja identifikacija bakterija (enterobakterije)
Detekcija Ag
DIREKTNA
BAB test (brucele)
IMUNOAGLUTINACIJA
Detekcija At (Ag vezan za nosac)
Lateks RF test (reumatoidni faktor)
INDIREKTNA (pasivna)
Detekcija Ag (At vezano za nosac)
HBsAg test (hepatitis B virus)
8
IMUNOPRECIPITACIJA
9
IMUNOPRECIPITACIJA je reakcija izmedu solubilnog
(rastvorljivog) antigena i odgovarajucih
specificnih antitela
Antigen je najcešce neki produkt mikroorganizma
(npr. toksin) ili protein plazme i drugih
telesnih tecnosti (imunoglobulini, komponente
komlementa itd.)
Rezultat reakcije je precipitat (talog), tj.
dolazi do izdvajanja antigen-antitelo komkpleksa
u vidu taloga
Do formiranja precipitata dolazi u zoni
ostvarivanja ekvivalentnog (optimalnog) odnosa
koncentracija antitela i antigena
10
Metodi imunoprecipitacije mogu da se odigravaju u
tecnoj sredini
slobodnom difuzijom (talog se formira posle
nekoliko minuta)
polucvrstoj sredini (gelu)
slobodnom difuzijom (talog se formira posle više
dana)
pomocu elektricne struje (talog se formira posle
nekoliko sati)
11
PRIMER
RING test (Kvalitativna)
Askolijeva reakcija (antraks)
U TECNOJ SREDINI
odredivanje koncentracije proteina u
serumu (Ig, komponente C?)
Nefelometrija (Kvantitativna)
IMUNOPRECIPITACIJA
Dvostruka imunodifuzija (Kvalitativna)
Elekova proba (difterija)
U POLUCVRSTOJ SREDINI (GELU)
odredivanje koncentracije proteina u
serumu (Ig, komponente C?)
RID test (Kvantitativna)
12
Interfacijalni (interfazni) test prstena RING
test (princip)
13
Nefelometrija (princip)
14
Dvostruka imunodifuzija u gelu Elekova proba
(princip)
15
Jednostruka radijalna imunodifuzija RID
test (princip)
At u gelu
2
Ag u rupice
3
1
1 standard poznate koncentracije
2 standard poznate koncentracije
3 standard poznate koncentracije
4 uzorak pacijenta
5 uzorak pacijenta
RID
IgG
4
5
16
Jednostruka radijalna imunodifuzija RID
test (princip)
D2 (mm2)
3
2
1
4
5
Ag koncentracija (g/l)
17
ANTIGEN-ANTITELO REAKCIJE SA OBELEŽENIM REAGENSIMA
18
ANTIGEN-ANTITELO REAKCIJE SA OBELEŽENIM
ANTITELIMA
M
M - marker
At
Fc
Fab
Fab
ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) -
marker ENZIM
IMUNOFLUORESCENCIJA (IF) - marker FLUORESCENTNA
BOJA
RADIOIMMUNO ASSAY (RIA) - marker RADIOAKTIVNI
IZOTOP
19
Enzimski imuno-test (ELISA)
Koristi se za detekciju antigena u tecnim
uzorcima (npr. serumu) ili antitela (tipicno u
serumu)
Marker je enzim, a obeleženo je primarno At
(specificno za antigen) ili sekundarno At
(anti-Ig antitelo)
Bazira se na principu promene boje supstrata pod
dejstvom enzima
Signal se detektuje kolorimetrijski (pomocu
spektrofotometra)
Može da bude kvalitativna ili kvantitativna
Obavlja se u plocama za mikrotitraciju (plocama
sa 96 rupica)
20
ELISA (ploca sa pozitivnim uzorcima primer 1)
21
ELISA (ploca sa pozitivnim uzorcima primer 2)
22
ELISA (detekcija Ag u tecnom uzorku - SANDWICH
ELISA)
uzorak (serum)
neobeležena Ag-specificna At
23
ELISA (detekcija Ag u tecnom uzorku - SANDWICH
ELISA)
12
6
Ispiranje
Inkubacija
24
ELISA (detekcija Ag u tecnom uzorku - SANDWICH
ELISA)
12
obeležena Ag-specificna At
6
Ispiranje
Inkubacija
25
ELISA (detekcija Ag u tecnom uzorku - SANDWICH
ELISA)
12
dodavanje supstrata
6
Kolorimetrijska detekcija
26
ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu
pacijenta)
Ispitivani serum
Antigen kojim je obložena ploca
27
ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu
pacijenta)
12
6
Ispiranje
Inkubacija
28
ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu
pacijenta)
Obeležena Ig-specificna At
29
ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu
pacijenta)
12
6
Inkubacija
30
ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu
pacijenta)
Ispiranje
31
12
ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu
pacijenta)
6
Kolorimetrijska detekcija
32
(No Transcript)
33
Imunofluorescencija (IF)
Koristi se za detekciju antigena u cvrstim
uzorcima (npr. na ili u celiji/tkivu) ili
antitela (tipicno u serumu)
Marker je fluorescentna boja (fluorohrom), a
obeleženo je primarno At (specificno za antigen)
ili sekundarno At (anti-Ig antitelo)
Bazira se na principu emitovanja boje pod
dejstvom UV svetla
Signal se detektuje pomocu fluorescentnog
mikroskopa
Može da bude samo kvalitativna i eventualno
semi-kvantitativna
Obavlja se obicno na mikroskopskim plocicama
34
Detekcija Ag u/na celijama i tkivima
DIREKTNA (DIF) (obeleženo primarno At)
specificnost
IMUNOFLUORESCENCIJA
Detekcija Ag u/na celijama i tkivima
INDIREKTNA (IIF) (obeleženo sekundarno At)
osetljivost
Detekcija At u serumu
35
Imunofluorescencija (primer 1)
Helicobacter pylori
Borrelia burgdorferi
36
Imunofluorescencija (primer 2)
Neutrofili
37
Imunofluorescencija (primer 3)
Glomerulonefritis
38
(No Transcript)
39
DIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u
cvrstom uzorku)
obeležena Ag-specificna At
fiksirani uzorak
40
DIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u
cvrstom uzorku)
12
6
Ispiranje
Inkubacija
41
DIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u
cvrstom uzorku)
Ekscitacija
Fluorescencija
42
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u
cvrstom uzorku)
neobeležena Ag-specificna At
fiksirani uzorak
43
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u
cvrstom uzorku)
6
Ispiranje
Inkubacija
44
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u
cvrstom uzorku)
Obeležena Ig-specificna At
Inkubacija
45
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u
cvrstom uzorku)
12
6
Inkubacija
46
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u
cvrstom uzorku)
Ispiranje
47
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u
cvrstom uzorku)
Ekscitacija
Fluorescencija
48
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u
serumu pacijenta)
Ispitivani serum
fiksirani antigen
49
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u
serumu pacijenta)
6
Ispiranje
Inkubacija
50
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u
serumu pacijenta)
Obeležena Ig-specificna At
Inkubacija
51
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u
serumu pacijenta)
12
6
Inkubacija
52
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u
serumu pacijenta)
Ispiranje
53
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u
serumu pacijenta)
Ekscitacija
Fluorescencija
54
Radio-imunotest (RIA)
Koristi se za detekciju antigena u tecnim
uzorcima (npr. serumu) ili antitela (tipicno u
serumu)
Marker je radioaktivni izotop (npr. 125I), a
obeležen je ili antigen ili antitelo
Bazira se na principu radioaktivnosti
Signal se detektuje pomocu brojaca (broj raspada)
Vrlo osetljiv kvantitativan test
Problem zbog rada sa radioaktivnošcu i odlaganja
otpada
55
Antigen-antitelo reakcije zavisne od komplementa
56
Ag-At reakcija in vitro koje postaju detektabilne
(merljive) usled aktivacije prisutnog komplementa

• Koriste se za
• Funkcionalno ispitivanje komplementa
• Test titracije komplementa

2. Detekciju antigena ili antitela
Reakcija vezivanja komplementa (RVK)
Mikrocitotoksicni test (HLA tipizacija)
57
Test titracije komplementa (Funkcionalno
ispitivanje komplementa)
Postupak za odredivanje ukupne hemolizne
aktivnosti C
Zasniva se na lizi senzibilisanih eritrocita
(eritrocita obloženih anti-eritrocitnim
antitelima) u toku aktivacije klasicnog puta
Izražava se u CH50 jedinicama u ml
(spektrofotometrijski na osnovu opticke
gustine
oslobodenog hemoglobina) CH100 jedinicama u ml
(golim okom)
58
Reakcija vezivanja komplementa (Test fiksacije
komplementa)
Postupak za odredivanje specificnih antitela
(npr. za respiratorne viruse) u serumu
pacijenata
Zasniva se na lizi senzibilisanih eritrocita
(eritrocita obloženih anti-eritrocitnim
antitelima) usled aktivacije komplementa
nastalim Ag-At kompleksima
http//highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/s
tudent_view0/chapter31/animation_quiz_4.html
59
Reakcija vezivanja Komplementa (princip)
Serum sa antitelima
Serum bez antitela
Serum

Antigen vezan
Antigen slobodan
Antigen
Liza eritrocita negativan Odsustvo
lize eritrocita (eritrocitno dugme) pozitivan

Komplement vezan (aktiviran)
Komplement slobodan (neaktiviran)
Komplement

Komplement aktiviran
Nema komplementa
Senzibilisani Er (indikator)

Nema lize Er Taloženje Er
Liza Er
Rezultat
Negativan
Pozitivan
60
Brzi test za otkrivanje trudnoce(demonstracija)
61
BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOCE (princip)

• detekcija beta HCG u urinu trudne žene
• koriste se tri vrste antitela
• 1. anti-HCG antitelo - obeleženo koloidnim
  zlatom (slobodno)
• 2. anti-HCG antitelo neobeleženo (fiksirano za
  membranu)
• 3. anti-imunoglobulinsko antitelo neobeleženo
  (fiksirano za
• membranu)

62
BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOCE (rezultati)

uzorak (urin)
pozitivan

uzorak (urin)
negativan
63
BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOCE (pozitivan
rezultat)
uzorak (urin)
pozitivan
uzorak (urin)
neobeleženo anti-HCG At
anti-Ig At

HCG
difuzija
difuzija


obeleženo anti-HCG At
64
BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOCE (negativan
rezultat)
negativan
uzorak (urin)
uzorak (urin)
neobeleženo anti-HCG At
anti-Ig At

difuzija
difuzija
obeleženo anti-HCG At
http//bio-alive.com/animations/immunology.htm