Seminarska naloga pri predmetu biokemija

1
Seminarska naloga pri predmetu biokemija
Biokalorimetrija
2
Uporaba biokalorimetrije

• - pri razvoju zdravil
• pri preucevanju interakcij med proteini
• pri preucevanju organizacije proteinskih domen

3
Biokalorimetricne metode
ITC isothermal titration calorimetry DSC
differential scanning calorimetry PPC pressure
perturbation calorimetry
4
isothermal titration calorimetry (ITC)

• biofizikalna tehnika dolocanja termodinamicnih
  parametrov biokemijskih interakcij (npr.
  interakcije med proteini in ligandi)
• vezava liganda povzroci sprošcanje ali porabo
  toplote
• merjenje sprošcene/porabljene toplote omogoci
  dolocitev
• koeficient vezave (binding coefficent (Kb/Ka)
  koeficient disociacije (Kd 1/Ka))
• stehiometrijo reakcije
• spremembo entalpije (?H)
• spremembo entropije (?S)

5
ITC shema
Ladbury JE, Chowdhry BZ. Sensing the heat the
application of isothermal titration calorimetry
to thermodynamic studies of biomolecular
interactions. Chem Biol. 1996 Oct3(10)791-801.
Review.
6
ITC potek poskusa

• dodatek majhnih alikvotov vzorca (10 µL) v
  merilno celico
• merjenje (ne)dovajanja toplote merilni celici,
  ki je potrebna, da sta temperaturi referencne in
  merilne celice enaki (izotermno)

7
ITC analiza podatkov

• površina pod vsakim vrhom predstavlja toploto
• (-) dovajanje energije vzorcni celici
  (eksotermna rxn)
• () dovajanje energije vzorcni celici
  (eksotermna rxn)
• integracija toplote je izrisana v odvisnosti od
  molarnega razmerja liganda in makromolekule

8
displacement ITC
c P x Ka (Wisemann, 1989)

• ce je Ka liganda prevelika (gt 10e9/M) klasicna
  ITC odpove
• za uporabo ITC v teh primerih se uporabi
  predhodna titracija s šibkejšim ligandom
• Referenca Siguskjold, Analytical Biochemistry
  277, 260-266 (2000)

9
ITC izracuni
Ladbury JE, Chowdhry BZ. Sensing the heat the
application of isothermal titration calorimetry
to thermodynamic studies of biomolecular
interactions. Chem Biol.
1996 Oct3(10)791-801. Review. Leavitt S,
Freire E. Direct measurement of protein binding
energetics by isothermal titration calorimetry.
Curr Opin Struct Biol. 2001 Oct11(5)560-6.
Review.

10
differential scanning calorimetry (DSC)

• termodinamicna analiza, ki meri razliko v
  kolicini toplote, ki je potreba, da se dvigne
  temperatura referencne in merilne celice
• uprabna za preucevanje
• konformacijske spremembe makromolekul
• zvijanje in razvijanje proteinov
• preucevanje afinitete vezave ligandov

11
DSC potek poskusa
DTA (differential thermal analysis)
DSC (differential scanning calorimetry)
obe celici se segreva tako, da je razlika med
celicama enaka, meri se kolicina toplote, ki je
potrebna, da sta obe celici na enaki T izriše se
graf razlike energije kot funkcija T vzorcne
celice
med segrevanjem se meri razlika med T referencne
in vzorcne celice izriše se graf ?T v odvisnosti
od T
Clas SD, Dalton CR, Hancock BC. Differential
scanning calorimetry applications in drug
development.Pharm. Sci. Technol. Today. 1999
Aug2(8)311-320.
12
DSC primer termograma
Stabilizacija fenilalanin hidroksilaze z L-Phe
Weber PC, Salemme FR. Applications of
calorimetric methods to drug discovery and the
study of protein interactions. Curr Opin Struct
Biol. 2003 Feb13(1)115-21. Review.
13
DSC uporaba

• za dolocanje koeficientov vezave (Ka)
• dodatek liganda povzroci (praviloma) dvig Tm
  zaradi povecanje stabilizacijske energije, bolj
  mocna vezava liganda ? vecji dvig Tm
• uporabno za šibke in še posebej za mocne ligande
  (kjer klasicna ITC odpove)
• možno dolocanje koeficienta vezave za ligande s
  koeficientom vezave 10e20/M
• ref Brandts Lin, Biochemistry 29, 6927-6940
  (1990)
• dolocanje stabilnosti proteinov pri nizkih
  temperaturah
• ref Brandts, Journal American Chemical Society
  86, 4291-4301 (1964)

14
PPC (pressure perturbation calorimetry)

• uporaba modificiranega DSC instrumenta
• na referencno in vzorcno celico se aplicirajo
  pulzi tlaka(0-5atm)
• preucevanje volumetricnih lastnosti proteinov
• dolocitev ekspanzijskega koeficienta (a)
• koeficinet ekspanzije pri Tm je lahko
• negativen, npr. ribonukleaza
• pozitiven, npr. kimotripsinogen
• preucevanje volumetricnih sprememb proteinov v
  povezavi z ligandi
• ref A. Cooper et al. 2001. Heat does not come in
  different colours entropyenthalpy compensation,
  free energy windows, quantum confinement,
  pressure perturbation calorimetry, solvation and
  the multiple causes of heat capacity effects in
  biomolecular interactions. Biophysical Chemistry.
  93 215-230

15
Preucevanje interakcij ligand-protein

• vezava liganda na protein se kaže v entalpiji
  (?H) in entropiji (?S) reakcije ter posledicno
  prosti energiji asociacije -
  vezava liganda vedno negativna prosta energija
  (tj. ?G lt 0 ? eksergone
  reakcije), možne kombinacije

?H lt 0 T?S gt 0 Reakcija je favorizirana entalpijsko in entropijsko
?H lt 0 T?S lt 0 Reakcija je favorizirana entalpijsko ne pa tudi entropijsko
?H gt 0 T?S gt 0 Reakcija je favorizirana entropijsko ne pa tudi entalpijsko
?G ? H T ? S Gibbsova prosta energija
za spontane reakcije
velja ?G lt 0
16
Preucevanje interakcij ligand-protein
Primeri
17
Preucevanje interakcij ligand-protein
Primeri
Anomalija - destabilizacija proteina - zaradi
kovalentne modifikacije proteina - zaradi
ekstrakcije ionov, ki stabilizirajo protein -
zaradi delovanja liganda kot nespecificnega
detergenta
18
Kalorimetrija in razvoj zdravil
John E. Ladbury. Isothermal titration
calorimetry application to structure-based drug
design. Thermochimica Acta, Volume 380, Issue 2,
14 December 2001, Pages 209-215
19
Preucevanje organizacije proteinskih domen

• DSC omogoca analizo razlicnih proteinskih domen
  in preucevanje denaturacije proteina
• primer fenilalanin hidroksilaza (tetramerni
  encim) ima tri razlicne domene (regulatorno,
  kataliticno in oligomeracijsko)
  denaturacija poteka
  v treh stopnjah
• 1. razvijanje vseh štirih regulatornih domen
  (tranzicija pri nizki T)
• 2. razvijanje dveh (od štirih) kataliticnih
  domen (tranzicija pri visoki T)
• 3. ireverzibilna denaturacija (eksotermno)

Thorolfsson et al. L-phenylalanine binding and
domain organization in human phenylalanine
hydroxylase a differential scanning calorimetry
study. Biochemistry. 2002 Jun 1841(24)7573-85.
20
Preucevanje organizacije proteinskih domen

• okoljski vplivi imajo lahko velik vpliv na
  podatke dobljene s pomocjo DSC

Azuaga AI, Dobson CM, Mateo PL, Conejero-Lara F.
Unfolding and aggregation during the thermal
denaturation of streptokinase. Eur J Biochem.
2002 Aug269(16)4121-33.
21
Razvoj instrumentacije

• konvencionalna DSC ali ITC analiza zahteva 0,5
  g cistega proteina in izkušen raziskovalec je
  sposoben 5-10 analiz / napravo na dan
• avtomatizacija DSC naprav je omogocila redukcijo
  vzorca na 130 µg cistega proteina in analizo 50
  vzorcev na dan (MicroCal VP-Capillary DSC)
• zaradi omejene kapacitete so testi uporabni le
  za sekundarni screening zdravil, a toliko bolj
  pomembni, saj povejo, ce se ligand veže
  reverzibilno in ima visoko afiniteto
• možno tudi dolocanje Tm z uporabo barvil, ki se
  selektivno fluorescirajo ko se vežejo na
  denaturiran protein
• screening na 384 jamicni mikrotitrski plošcici
  ( 0,5 µg vzorca), cas analize 30-90 min ? high
  throughput metoda

Weber PC, Salemme FR. Applications of
calorimetric methods to drug discovery and the
study of protein interactions. Curr Opin Struct
Biol. 2003 Feb13(1)115-21. Review.
http//www.microcal.com/
22
Zakljucki

• analiza termodinamicnih pojavov pomaga pri
  razumevanju
• zvijanja proteinov
• razvoju novih zdravil
• interakcij med molekulami
• skupaj s poznavanjem proteinskih struktur in
  dinamik nam omogoca boljše razumevanje delovanja
  bioloških sistemov