NESTED%20E%20MULTIPLEX%20PCR

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NESTED E MULTIPLEX PCR
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS DISCIPLINA DE
BIOLOGIA MOLECULAR

• Rodrigo Schuch, Arthur de Castro,
• Renan Piraine e Gabriel Urtiaga

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PCR

• Reação em cadeia de polimerase que visa a
  amplificação de segmentos de DNA in vitro.

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Aplicações do PCR

• Detecção de mutações ou preparação de fragmentos
  de
• DNA para clonagem
• Caracterização de Doenças
• Taxonomia de Microorganismos
• Estudos de padrão de expressão gênica
• Seqüenciamento direto de produtos amplificados
• Diagnóstico pré-natal
• Grande uso na Medicina Forense

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NESTED PCR

• Método que utiliza dois conjutos de primers em
  duas operações de PCR
• Duas reações de PCR separadas
• O segundo processo visa amplificar o gene de
  interesse do PCR primário
• Aumenta a precisão e a confiabilidade do
  processo de PCR

Principio do Método
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NESTED PCR
Elementos Necessários

• DNA molde
• Dois conjuntos de Oligonucleotídeos (primer)
• dNTPs
• DNA Polimerase
• Magnésio
• Tampão
• Água

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Mecanismo
NESTED PCR

• Fase de Desnaturação
• Anelamento
• Polimerização

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Mecanismo

• PRIMEIRA CORRIDA
• O DNA alvo sofre a primeira corrida de
  polimerase
• 1º CONJUNTO DE PRIMERS EM VERDE
• Essa etapa fornece um produto de PCR com a
  sequência, porém ainda inespecífico

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Mecanismo

• SEGUNDA CORRIDA
• O produto desse primeiro PCR sofre uma
  segunda corrida
• 2º CONJUNTO DE PRIMERS EM VERMELHO

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NESTED PCR
Mecanismo
Os primers são específicos para sequência-alvo
(improvável contaminação de produto nao desejado,
poucos dímeros de PRIMERS)
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Controle da Qualidade Nested PCR
NESTED PCR

• Pelo desenho dos Primers
• Condições de Ciclagem
• Concentração de Reagentes
• Composição do Tampão
• Concentração de Primers (evitar dímeros de
  Primers Contaminação)
• NESTED Verificação de possiveis contaminação é
  verificado por gel de Agarose na Primeira corrida

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Comparativo PCR Normal
NESTED PCR
FIDELIDADE
RENDIMENTO
PRECISÃO DA REPLICAÇÃO
Se um locus for amplificado erroneamente, a
probabilidade é muito pequena de ser amplificado
novamente pelo segundo par de primers.
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Utilização em Pesquisa
NESTED PCR

• Atuais 345.634 artigos no PubMed

• Atuais 173 artigos no SciELO (Brasil)

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Artigo
Nested-PCR do gene que codifica o antígeno b
aplicada ao diagnóstico da tuberculose pulmonar

• Alternativa complementar a pesquisa de bacilos
  álcool ácido resistentes e
• a cultura do Mycobacterium tuberculosis em
  meio de Lowenstein-Jensen
• A sensibilidade da nested-PCR foi 96 enquanto
  a especificidade foi 48
• Poderá ser uma ferramenta complementar para o
  diagnóstico da
• tuberculose, pois apresenta sensibilidade
  equivalente à cultura
• Necessita de maiores avaliações visando
  minimizar o número de
• resultados falso-positivos

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Artigo
Leptospirosis Diagnosis using Nested-PCR

• Utilização da técnica NESTED PCR para diagnostico
  de Leptospirose
• Primeiro PCR mostrou-se específico para
  leptospiras patôgenicas, porém a sensibilidade
  não foi muito alta (Gene LipL32 264 pb).
• Foi então desenhado um segundo par de Primers
  (amplifica uma região de 183 pb do gene LipL32,
  interna a de 264 pb)
• O Nested-PCR mostrou-se mais sensível que o PCR
  normal, pois foi capaz de detectar um baixo
  número de células bacterianas

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MULTIPLEX PCR
Principio do Método

• Variante do PCR que permite a amplificação de
  vários genes em uma mesma reação
• É utilizado vários conjunto de primers (variam
  conforme genes em questão)
• Descrito em 1988 por Chamberlain et al,
• Ensaios Multiplex podem ser tediosos e demorados
  para se estabelecer, exigindo procedimentos de
  otimização demorado.

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Aplicações
MULTIPLEX PCR

• Aplicações onde a análise simultânea de múltiplos
  marcadores é necessária
• Permite detecção de patógenos ou de organismos
  geneticamente modificados (OGM), ou por análise
  de microssatélites
• Deleção de um gene ou detecção de mutação
• Polimorfismos repetitivos do DNA
• Detecção e caracterização de microorganismos
• Análise no diagnóstico de doenças

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Elementos Necessários
MULTIPLEX PCR

• Água
• DNA genômico
• Taq DNA polimerase
• Primers mix (tipos variam de acordo com a
  quantidade de
• genes envolvidos)
• dNTPs mix
• Tampão 10X

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Questão especial Primers
MULTIPLEX PCR

• Método envolve grande numero de primers
• TAMANHO Comprimento primer de 18-24 pb ou
  superior
• TEMPERATURA 55C 60C
• Com muitas bases GC 75C 80C

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Questão especial Primers
MULTIPLEX PCR

• CONTEÚDO Com percentual de GC entre 35 e 60,
• ESPECIFICIDADE Desenho de acordo com a
  sequencia alvo
• CUIDADO Dímeros de Primers (torna a
  amplificação não específica)

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Concetração dos Primers
MULTIPLEX PCR

• Uso de primers em quantidades equimolares
• Se não houver amplificação uniforme aumenta-se
  ou diminui a quantidade de alguns pares de
  primers em relação a outros.
• Isto é particularmente importante nas amostras
  onde um alvo é mais abundante do que outros.
• Quantidade de primers disponíveis, bem como
  demais elementos, limitam a reação da DNA
  polimerase, bem como aumentam o tempo de reação

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Mecanismo
MULTIPLEX PCR

• Primeira desnaturação - 2 a 5 min a 94 C
• Desnaturação 30 s a 94 C
• Anelamento 30 a 60 s a 54C a 58C
• Extensão 1 a 2 min 65C a 72C
• Última extensão 5 a 10 min a 72C

O tempo e as temperaturas devem ser
adaptadaspara os primers específicos e de acordo
com a sequencia-alvo.
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Tempo Temperatura
MULTIPLEX PCR
Comparação de equivalentespistas mostra uma
melhora no rendimento quando o tempo de extensão
é de 2 min.
A reação ocorre melhor em temperaturas de
extensão menores
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Mecanismo
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Controle de Qualidade Multiplex PCR
MULTIPLEX PCR

• Dimensão relativa dos fragmentos
• Pode-se fazer um PCR individual para verificar a
  expressão de cada genes (restrição e uso de sonda
  e hibridização)

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(No Transcript)
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Comparativo PCR Normal
MULTIPLEX PCR

• Numa única reação de PCR é possível fazer a
  amplificação de diversos alvos.
• Em comparação com o Nested-PCR é muito mais
  rápido (somente uma reação).
• Economia maior da enzima Polimerase
• Economia de reagentes

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MULTIPLEX PCR
Comparativo PCR Normal

• Maior Controle Interno Uniplex geralmente
  apresenta falsos positivos e negativo (cada
  amplicon vai fornecer um controle interno para
  outros amplicons)
• Menor risco de contaminação
• Ensaios Multiplex podem ser tediosos e demorados
  para se estabelecer, exigindo procedimentos de
  otimização demorado.

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Utilização na Pesquisa
MULTIPLEX PCR

• Atuais 6880 artigos no PubMed

• Atuais 79 Artigos no SciELO (Brasil)

29
Artigo
Monitoramento de pacientes com AIDS para o
desenvolvimento de doença por citomegalovirus
(CMV) usando-se PCR multiplex

• Patógeno importante em indivíduos infectados
  pelo vírus da
• imunodeficiência humana (HIV)
• Um protocolo de PCR multiplex que fornece
  informações de quantificação
• de DNA amplificando somente um ou dois genes
  alvo do CMV foi utilizado
• (genes IE e LA)
• Os processos usados para a detecção doCMV
  incluem o isolamento do
• vírus por cultura, detecção da antigenemia18
  ou de ácidos nucléicos virais.
• A reação em cadeia da polimerase (PCR)
  detecta o DNA do CMV em
• leucócitos e é considerada um método
  sensível e promissor

30
Artigo

• O DNA extraído das amostras de sangue foi
  submetido à amplificação
• na presença de dois pares de iniciadores
  específicos para duas regiões
• do genoma do citomegalovírus.
• O acompanhamento desses pacientes comPCR
  multiplex discriminou o grupo de pacientes que
  apresentava a maior probabilidade do
  desenvolvimento de doença por CMV.

31
Artigo
32
Artigo
PCR multiplex para identificação de isolados de
Clostridium chauvoei e Clostridium septicum

• Detecção de Clostridium chauvoei e Clostridium
  septicum em
• culturas puras (causam mionecroses)
• O diagnóstico das mionecroses tradicionalmente
  tem sido feito
• baseando-se no cultivo e isolamento dos
  microrganismos
• envolvidos.
• Entretanto, o tempo necessário para o cultivo e
  isolamento, é de
• quatro dias a uma semana.

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Artigo

• Utilizados pares de iniciadores para segmentos
  específicos dos genes
• que codificam a flagelina de C. chauvoei e
  a toxina alfa de C.Septicum
• (fatores de Virulência)
• Importancia da PCR multiplex pela rapidez e
  precisão na
• diferenciação destes microrganismos, além da
  utilização de diferentes
• primers em uma mesma reação o que reduz os
  custos do teste

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Artigo

• 1 Marcador de peso molecular 5 DNA genômico
  de C. sordellii
• 2 amplificação das duas culturas 6 DNA
  genômico de C. novyi tipo A
• 3 amplificação de C. septicum 7 DNA genômico
  de C. perfringens tipo A
• 4 amplificação de. Chauvoei 8 controle
  negativo

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• OBRIGADO!

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Referências Bibliográficas

• http//genome.cshlp.org/content/3/4/S65.refs.html
• http//www.scielo.br/scielo.php?scriptsci_pdfpid
  S0037-86822007000200013lngennrmisotlngpt
• http//www.scielo.br/scielo.php?scriptsci_arttext
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• http//www.scielo.org.ve/scielo.php?pidS0378-1844
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• http//www.bio.davidson.edu/courses/genomics/metho
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• http//www.fisiologia.kit.net/biomol/4.htm
• http//www.lume.ufrgs.br/handle/10183/4663
• http//www.nature.com/nprot/journal/v1/n2/fig_tab/
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• http//www.nist.gov/mml/biochemical/genetics/rapid
  _pcr.cfm
• http//www.mpsciences.com/index-3.html
• http//www.nist.gov/manuscript-publication-search.
  cfm?pub_id830184http//www.lume.ufrgs.br/handle/
  10183/4663
• http//en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reac
  tion