Avalia

1
Avaliação da diversidade microbiana

• (Independentes de cultivo)

Técnicas moleculares
Expressões da diversidade
2
Avaliação da diversidade microbiana (métodos
independentes de cultivo)
Equitabilidade abundância relativa de cada grupo
Riqueza número de grupos presentes

• Técnicas que envolvem ácidos nucléicos (RNA ou
  DNA).
• Essas técnicas permitem avaliar diversidade (quem
  está ali?)
• O potencial metabólico ou atividade quando genes
  metabólicos ou seus transcritos sejam usados nas
  sondas (o que fazem?)
• Métodos mais diretos e analíticos (como FAME).

3
Dogma Central da Biologia Molecular
Sequências rRNA são extremamente importantes em
estudos filogenéticos porque são conservadas
(evoluiram lentamente) participando na síntese da
estrutura dos ribossomos e de proteínas. rDNA
indica os genes que codificam para o RNA
ribossômico. A maioria dos genes metabólicos são
regulados ao nível da transcrição e podem não
ser expressos - potencial metabólico. Se o
transcrito do gene é expresso então ele será
expresso e seu produto será sintetizado -
atividade metabólica.
4
Características dos ácidos nucléicos

• Dois tipos de ácidos RNA e DNA
• DNA é codificado por 4 blocos intercambiáveis
  denominados bases Adenina, Guanina, Citosina e
  Timina.
• RNA tem 5 bases diferentes Adenina, Guanina,
  Citosina e Uracila.

5
Deoxyribonucleic Acid
Ácido desoxiribonucleico DNA
Pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas
6
Porque os estudos de diversidade usam o rDNA?
Gene que codifica para rRNA 16S
Cerca de 1500 pb codificam para a subunidade 16S
da molécula de RNA. Parte destas sequências são
conservadas para a maioria dos seres vivos
-contém o passado metabólico do último ancestral
comum. Regiões variáveis são usadas na taxonomia
- filogenética
7
rDNA
Estrutura primária (sequência) e secundária
(laços e dobraduras) ordenam a estrutura
terciária (3D) dos ribossomos.
Mapa de variabilidade de SSU rDNA
bacteriano Vermelho genes altamente conservados
SSU (small subunit) 16S
8
Como se replica o DNA?

• Abertura da dupla fita via reações químicas
  simples e reconstituição da outra metade de cada
  fita por imersão em uma mistura composta pelas
  quatro bases.
• Cada base pode se combinar apenas com uma única
  base complementar. Portanto, uma base na fita
  antiga () define qual base pode ocorrer na
  fita nova (-)
• Dessa forma, após cada abertura da fita, são
  coletadas do substrato réplicas completas da fita
  original, exceto quando ocorrer uma mutação.

(Complementaridade das bases)
9
Replicação do DNA
O crescimento do DNA ocorre na direção de 5' para
3'
Vídeo 1
Vídeo2

• As duas fitas de DNA estão em direção opostas
  (anti-paralelas)
• uma das fitas tem a direção exata da sua síntese
  (5'---3')
• enquanto que a outra está invertida (3'---5').
• Esta conformação em fitas anti-paralelas leva à
  necessidade de mecanismos especiais para a
  replicação do DNA.

10
Sondas de ácidos nucléicos Sondas são
pequenas porções de DNA (ou RNA) de sequência
conhecida usadas para identificar a presença de
DNA complementar na amostra.

• Ocorre pareamento espontâneo resultante da
  complementaridade das bases.
• É o princípio das técnicas usadas para detectar
  e caracterizar genes.
• Tecnologia das sondas gênicas é usada para
  identificar genes individuais ou sequencias de
  DNA.
• A ligação das fitas (sonda amostra ) se
  denomina IBRIDIZAÇÃO.
• Duas fitas devem ter pelo menos 16-20 bases
  complementares consecutivas para formar uma fita
  estável e complementar.
• 1. Sondas podem ser marcadas com
  radioisótopos, enzimas, fluorocromo e
  substratos quimioluminescentes.
• 2. Hibridização pode ocorrer em suportes
  sólidos ou líquidos

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Sonda é uma assinatura das sequências genéticas
de um organismo ou um gene
Tipos de sondas gênicas

1. Sonda funcional - baseada nos genes de uma função
   específica.
2. Sonda filogenética - baseada nas sequências das
   subunidades rRNA.
3. Sonda de oligonucleotídio - pequena sequência, de
   20 a 70 nucleotídios.

12
Dot-Blot
Técnicas de hibridização (detecção de
biomoléculas)

• A amostra (mistura que contém a molécula alvo) é
  aplicada pontualmente em uma membrana, depois
  aquecida para desnaturar o DNA
• Adiciona-se sondas marcadas
• A amostra é lavada para remoção da sonda não
  hibridizada e avalia-se os reagentes.
• Método qualitativo,
• As vezes difícil de interpretar,
• Simplificação dos outros métodos de hibridização.

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Hibridização dot-blot Detecta rapidamente a
presença de biomoléculas Não informa sobre os
tamanhos das moléculas
100 transgênico
Hibridização dot-blot (DNADNA) entre o genoma de
milho e um sonda 35S do CAMV (vírus do mosaico da
couve-flor promotor utilizado em
transgenia). Linha superior 1100 transgênico
2 10 transgênico 3 5 transgênico 4 1
transgênico, 5 0.5 transgênico 6 controle
negativo. 7água Linha inferior 1crioulo B1
2crioulo B2 3crioulo B3 4crioulo A1
5crioulo A2 6 crioulo A3 7 milho do Peru,
controle negativo.
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Southern Blot

• Fragments de DNA são separados por eletroforese
• O gel da eletroforese é tratado com álcalis para
  desnaturar a dupla fita.
• Transfere-se por contato o DNA desnaturado para
  uma membrana (nitrocelulose ou Nylon)
• Fixa-se o DNA na membrana por aquecimento (ou UV)
• Aplica-se uma sonda hibridizadora marcada
  (molécula de DNA conhecida e idêntica àquela que
  se quer encontrar).
• Lavagem para retirada do excesso de sonda
• Revelação por radiografia ou aparecimento de cor,
  caso a molécula alvo esteja presente.

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Southern BlotTransferência do DNA para uma
membrana
membrana

• Baseado no fato que fragmentos de DNA aderem a
  membranas de nitrocelulose ou Nylon
• A membrana é colocada acima de um gel de agarose
  e abaixo de um material absorvente.
• Com o tempo os fragmentos de DNA se transferem do
  gel para a membrana por capilaridade.
• Após a transferência, a membrana é lavada e os
  fragmentos expostos a UV ou calor para fixação.
• A membrana torna-se uma imagem do DNA presente
  no gel.

16
Técnica do Southern Blot
17
Como são preparados os fragmentos de DNA?-
Enzimas de restrição
Endonucleases (ou enzimas) de restrição São
proteínas que reconhecem sítios específicos das
sequências de nucleotídeos e clivam ambas as
fitas de DNA. tesouras
moleculares Descoberta na década de 70 como um
mecanismo de defesa de bactérias contra
bacteriófagos, hoje é uma ferramenta da biologia
molecular para fabricação de novas moléculas.
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Southern Blot Ex. teste de paternidade
Mãe azul Pai amarelo Seus 4 filhos D1 (filha
biológica), D2 (enteada, filha da mãe e ex-marido
(vermelho), S1 (filho biológico), and S2 (filho
adotivo,não relacionado biologicamente com pais).
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Northern Blot (Utiliza RNA em vez de DNA,
propiciando estudos de expressão gênica)

• Permite a investigação do peso molecular de um
  mRNA e avaliar quantidades relativas de mRNA em
  diferentes amostras.
• RNA (RNA total ou apenas mRNA) é separado por
  eletroforese.
• O RNA é transferido para membrana especial
  (nitrocelulose).
• A amostra é incubada com uma sonda de DNA (ou
  RNA) fita única marcada.
• A sonda hibridizará caso ocorra complementaridade
  formando uma molécula dupla fita (molécula
  RNA-DNA).
• A localização da sonda é revelada por incubação
  com uma substância que ligada a enzima
  converte-se produto colorido ou que exposta a
  raios X pode ser revelada.

20
Northern Blot
21
Hibridização em solução

• Ambos ácido nucléico-alvo e sonda interagem
  livremente na solução.
• Neste caso maior sensibilidade do que em suporte
  sólido
• Requer menos amostra
• Sonda deve ser fita única e não deve formar dupla
  hélice (auto anelamento).
• Adaptável a automação particularmente quando se
  usam marcadores quimioluminiscentes.
• Rápido resultado em poucas horas.

22
Hibridização em solução
23
Biochips (Análise do perfil de expressão de
comunidades)
Microarranjos de DNA DNA microarrays Coleção
de porções de DNA aderidas a suportes sólidos
(vidro, plástico ou silicone) formando um
conjunto que visa monitorar a expressão de
múltiplos genes.
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Biochips microarranjos de DNA

• Um chip de DNA é um biosensor que analisa
  informações genéticas.
• Utiliza a complementaridade das 4 bases (A, T, G
  , C) no qual A emparelha com T e G emparelha com
  C através de pontes de H.
• Sequências de DNA contendo genes conhecidos
  (SONDAS de DNA) são colocadas num suporte em
  microsítios (alguns µm de diâmetro) e arranjados
  em filas.
• Genes extraídos de amostras e amplificados (PCR)
  são colocados no chip de DNA, possibilitando que
  caracteristicas como a presença de genes mutantes
  ou especificos sejam detectados através da
  hibridização.
• Importante para amostras ambientais, diagnóstico
  de doenças (câncer).

25
Como um biochip é produzido?

• Usa DNA, RNA ou oligonucleotídeos.
• Também podem ser de proteínas e de anticorpos.
• Permite a realização de milhares de reações
  biológicas de uma só vez.

26
Etapa 1 produção de sondas

• Usando técnicas convencionais, como PCR e síntese
  bioquímica, fitas de DNA específicas (sondas) são
  obtidas e purificadas.

Existe ampla variedade de sondas no mercado
27
Etapa 2 preparação dos pontos de ligação

• Usam-se robótica e nano-manufactura para colocar
  em vidro ou plástico os receptáculos (substratos)
  das sondas de DNA.

28
Etape 3 integração das sondas

• Utiliza-se uma variedade de processos
  (eletroforese até ligação usando robótica) para
  aderir o material genético ao substrato.
• Condições de assepsia total nesta etapa (salas
  esterilizadas) para impedir contaminações.

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Chip de DNA
30
(No Transcript)
31
Hibridização in situ

• Alvo ácido nucléico em células intactas.
• Fornece informação sobre a presença de DNA
  específico e sua distribuição ou localização em
  tecidos ou superfícies.
• Sondas devem ser suficiente pequenas para atingir
  o DNA.
• Podem usar marcadores radioativos ou
  fluorescentes.
• Requer experiência para interpretação.

32
Hibridização in situ com fluorescência (FISH)
33
Fluorescent In Situ Hybridization - FISH

• Bactérias do grupo alvo aparecem em vermelho.
• Restantes bactérias aparecem em azul
• (cores artificiais)

34
Combinação de FISH com DAPI
Permite a detecção simultânea do sinal da sonda
de DNA e sua localização no cromossomo.

• Azul corante DAPI
• Vermelho Grânulos internos indicando bactérias
  ativas em processo respiratório.

DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) é um corante
fluorescente que se liga fortemente com o DNA.
35
Reação de amplificação do DNA PCR (amplificação
gênica)

• O objetivo é fazer um número elevado de cópias de
  um gene ou sequência.
• Células são separadas e lisadas
• DNA dupla fita é separado em fita única.
• Iniciadores (primers) são adicionados (pequenos
  fragmentos de DNA, 2-30 nucleotídios)
• Primers são segmentos complementares aqueles que
  flanqueiam a sequência alvo
• Apenas os segmentos DNA alvo entre os primers
  serão replicados
• Cada ciclo térmico de PCR consiste de 3 etapas
• Desnaturação do DNA alvo (separação das fitas)
  94 C
• Anelamento por abaixamento da temperatura 55 C
• Extensão quando primers iniciam a síntese de DNA
  com uma DNA polimerase 72 C
• Cada ciclo resulta no dobro das sequências alvo
  (dura cerca de 60-90 seg). Geralmente usam-se
  30 ciclos.

36
Taq polimerase

• É uma enzima termoestável isolada da bactéria
  Thermus aquaticus, que habita em regiões
  hidrotermais.
• "Taq polimerase" é uma abreviatura de Thermus
  Aquaticus Polimerase.
• É geralmente usada no PCR porque é razoavelmente
  barata e pode suportar as condições da técnica
  (temperatura de desnaturação).

37
PCR
38
PCR
39
O que fazer com PCR?

• Amplificar genes 16S rDNA diretamente de amostras
  ambientais.
• Usar primers específicos de certos grupos
  detecção específica
• Detectar genes funcionais quando sua sequência é
  conhecida.

40
Métodos moleculares
Sondas gênicas Hibridização Biochips PCR
41
Perspectivas - O futuro?
Técnicas independentes de cultivo são essenciais,
mas são lentas e trabalhosas. Como torná-las mais
rápidas para utilizar em análises de comunidades
microbianas?
Processador automático
Amostras ambientais
Diversidade microbiana, atividade, potencial
metabólico,...

• Aumentar automação
• Uso da robótica
• Tecnologia de microarranjos de DNA

42
Expressões da diversidade
A diversidade refere-se tanto ao número (riqueza)
de diferentes categorias biológicas quanto à
abundância relativa (equitabilidade) dessas
categorias. Inclui variabilidade ao nível local
(diversidade alfa), entre habitats (diversidade
beta) e entre paisagens (diversidade gama).
43
Expressões da diversidadeMedidas objetivas
Diversidade de Margalef (Diversidade alfa) É um
índice simples que considera somente o número de
espécies (n-1) e o logarítmo do número total de
indivíduos. D (n-1)/ln N onde n é o número
de espécies amostradas N é o número total de
indivíduos em todas as espécies.
2 baixa diversidade gt 5 alta diversidade
Outros índices Diversidade de Gleason
Diversidade de Menhinick Diversidade de
Shannon-Wiener
44
Índices de heterogeneidade
45
Modelos de distribuição de abundância
Modelos estatísticos que permitem observar
variabilidade (número de espécies) e a
equitatividade (distribuição da abundância
relativa)
Log-normal Série geométrica
Broken stick Série logarítmica
46
Modelos de abundância
Broken stick
Abundância
Log normal
Série log
Série geométrica
Sequência das espécies
47
Características dos modelos Série geométrica
pressupõe comunidades onde uma espécie
preencheria um nicho e as demais ocupariam
proporcionalmente frações de nicho remanescentes.
Adequado para comunidades pobres e em estágios
iniciais de sucessão. Série logarítmica
representa comunidades governadas por um único
recurso, com os nichos remanescentes da ocupação
de uma espécie sendo ocupados aleatoriamente.
Comunidades mais maduras, em estágio mais
avançado de sucessão. Broken stick sugere uma
comunidade com alta equitabilidade
(heterogeneidade), regulada por fatores
ambientais pouco variáveis. Modelo baseado em
interações competitivas entre espécies de uma
comunidade. Log normal modelo satisfatório para
a maioria das comunidades. Resultado do Teorema
Central do Limite, que prevê a soma de muitos
fatores independentes com pequenos efeitos.
48
Embora os modelos descritos possibilitem uma
descrição mais completa dos dados de diversidade,
há a necessidade de se empregar modelos de
ajustamento, que podem ser trabalhosos e
demorados. Além disso, as comunidades estudadas
podem não se enquadrar em nenhum dos modelos.
Neste sentido, os índices de diversidade provêm
uma alternativa adequada para as medidas de
diversidade (Magurran, 1988).
49
Sumário
Diversidade tem dois componentes -
Variabilidade e Abundância relativa Etapas no
cálculo 1. Identificar o número de espécies 2.
Avaliar o número ou biomassa dentro de cada
espécie 3. Usar estes valores nas
expressões Pode-se calcular em diferentes níveis
de complexidade - genético, espécies e
comunidades As técnicas tem sensibilidades
diferentes e incluem - técnicas dependentes de
cultivo - técnicas independentes de
cultivo
50
FIM

• Próxima aula
• Estudos de caso

51
Glossário molecular

• cDNA
  Fazer cópia do mRNA na forma de DNA
• Enzimas de restrição
  Cortar o DNA em pontos específicos,
  fragmentando-o
• DNA ligase
  Ligar fragmentos de DNA
• Vetores
  Transportadores de DNA para as células de
  forma a assegurar sua replicação
• Plamídios
  Tipo de vetor
• Transferência gênica
  Colocar um gene em uma célula
• Marcadores genéticos Para
  identificar células que foram transformadas
• Placas réplica
  Fazer cópias exatas de colônias bacterianas em
  placas
• 9 PCR
  Técnica de amplificação de DNA
• 10 Sondas de DNA
  Identificar e marcar um pequena porção de
  DNA que contenha um seqüência específica.
• 11 Shotgun
  Pesquisar um gene particular no
  genoma total
• 12 Genes antisense
  Parar a expressão de um gene na célula
• 13 Eletroforese
  Separar fragmentos de DNA