Diapositiva 1

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Nuevos patógenos y protocolos a incorporar a
PulseNet Shigella flexneri y Enterobacter
sakazakii
5ta Reunión PulseNet América Latina (PN-AL)
23 al 25 de octubre 2007
Norma Binsztein Angela Salve
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Desarrollo de protocolo estandarizado de
PFGE para incorporación de Shigella flexneri a
PulseNet
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Necesidades de un protocolo diferente
a) Shigella flexneri especie mas frecuente en
América Latina y en Asia b) PFGE de
Shigella sonnei estandarizado en PulseNet c)
Resultados de PFGE de aislamientos de Shigella
flexneri con el protocolo de Shigella
sonnei d) Pedido de PN-AL a PN-Internacional de
estandarizar protocolo de PFGE para Shigella
flexneri aceptación
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Objetivo
Estandarizar un protocolo de PFGE y análisis
para
Shigella flexneri
Objetivos específicos

• 
  
• Utilizar las mismas condiciones de corrida para
  dos enzimas
• Simple, económico, reproducible y
  epidemiológicamente
• discriminatorio

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Antecedentes
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Grupo de trabajo en PFGE y BioNumerics de
Shigella flexneri

• Reunión Comité Directivo de PN Internacional
• Providence, USA - 16 de Abril 2007
• Presentación de resultados preliminares
• (CDC e Instituto Malbrán)
• Integrantes
• CDC
• NAMRU (US Naval Medical Rescarch Unit
• INEI Malbrán

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Protocolo de trabajo
1ª etapa Mayo a Octubre 2007
Campylobacter vs Yersinia modificado

• Condiciones de corrida
• Enzimas XbaI y NotI
• Aislamientos seleccionados
• - 7 de cada serotipo de Shigella flexneri
• - de brotes

2ª etapa Validación
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Conclusiones preliminares1º etapa

• Condición de corrida
• protocolo Yersinia modificado
• Enzimas XbaI y NotI
• 1ª enzima NotI
• 2ª enzima XbaI
• Buena discriminación de aislamientos asociados
• a brotes

Ventajas y Desventajas
?
Definición noviembre 2007
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Ejemplos XbaI-PFGE
Shigella flexneri 1, digeridas con XbaI con el
protocolo de Campylobacter sp vs Yersinia
modificado
Protocolo Campylobacter 6,8 a 35,4 seg
Protocolo Yersinia modificado 1,8 a 25 seg
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Ejemplos NotI-PFGE
Shigella flexneri 1, digeridas con NotI, con el
protocolo de Campylobacter sp vs Yersinia
modificado
Protocolo Campylobacter 6,8 a 35,4 seg
Protocolo Yersinia modificado 1,8 a 25 seg
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Desarrollo de protocolo estandarizado de
PFGE para incorporación de Enterobacter
sakazakii a PulseNet
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Enterobacter sakazakii
PulseNet América Latina está a cargo del
desarrollo
Antecedente 2006 PFGE de 22 aislamientos con la
condición de corrida de Shigella sonnei
enzima XbaI
Resultados a mejorar
Condición de corrida Yersinia modificado enzima
XbaI
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Enterobacter sakazakii 2007Resultados
preliminares
XbaI-PFGE
Protocolo Shigella sonnei 2,2 a 54,2 seg
Protocolo Yersinia modificado 1,8 a 25 seg
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Enterobacter sakazakii Plan de trabajo 2007-2008

• Continuar el estudio de todos los aislamientos
• existentes en la colección de cultivos del
  INEI (n22)
• - condiciones Yersinia modificado
• - enzimas XbaI y otra a elegir
• Realizar el análisis y comparación de los
  resultados con los dos protocolos (Shigella
  sonnei y Yersinia modificado)
• Discutir los resultados en el Comité Ejecutivo de
  PN-Internacional
• Seleccionar método
• Validar

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Modificaciones del protocolo estandarizado de
PFGE para Salmonella sp., Shigella sonnei y E.
coli O157
5ta Reunión PulseNet América Latina (PN-AL)
23 al 25 de octubre 2007
Angela Salve
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Principales Modificaciones

• DO de las suspensiones bacterianas
• DO de 1.0 a 610 nm
• NO AGREGAR SDS al 1 en la agarosa utilizada en
  la preparación de los plugs.
• Se puede usar una menor cantidad de enzima por
  plug (20 - 30 U)

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Utilización de Tiourea en cepas No Tipificables
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Cepas No Tipificables

• Hay aislamientos que muestran ADN degradado en
  el gel y se consideran no tipificables por PFGE
• Ejemplos algunas cepas de E. coli O157 y no
  O157 ciertas serovariedades de Salmonella, como
  Derby, Livingston, Ohio, Panama, Saintpaul y
  Cerro (donde todos los aislamientos pueden ser no
  tipificables) o algunas cepas de ciertas
  serovariedades tales como Newport, Miami y otras,
  que generalmente se pueden tipificar por PFGE

El agregado de 50 µM de tiourea en el buffer
de corrida previene la degradación de ADN
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Ejemplo de la Utilización de Tiourea
Salmonella Cerro
Con Tiourea
Sin Tiourea
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Muchas Gracias
a TODOS