Diffrenciation des cellules intestinales

1
Différenciation des cellules intestinales
stem cell
Math1
-Math1
-Math1
Matrice extracellulaire p27
Cellules sécrétrices
Cellules absorbantes
?
?
ngn3
cellules de Paneth
cellules en gobelet
cellules endocrines
2
La voie Notch dans la différenciation intestinale
3
Signalisation Notch

• Notch molécule transmembranaire
• 4 récepteurs (notch 1, ) et 5 ligands (delta 1-3
  -4 ou jagged 1-2)
• Lorsque notch interagit avec son ligand)
• Clivage de la partie intracellulaire de notch
  (Notch IntraCellular Domain), translocation dans
  le noyau
• Activation de la transcription de gènes
•  interrupteur 

4
Notch et différenciation

• Notch est impliqué dans le devenir des cellules
  lors du développement
• Chez ladulte, permet le maintien de
  lhomeostasie
• Cibles de la signalisation Notch Math-1, Hes-1,
  ngn3 qui sont impliqués dans la différenciation
• Surexpression de NICD (partie intracelllulaire de
  Notch) dans des souris transgéniques entraîne
  blocage de la différenciation des cellules
  sécrétrices.
• La signalisation notch est essentielle dans les
  cryptes pour maintenir létat indifférencié et
  prolifératif des cellules progénitrices.

5
Notch signals control the fate of immature
progenitor cells in the intestine

• Fre et al.
• Nature (2005) 435 964-968

6
introduction

• Les signaux via Notch sont impliqués dans le
  développement de nombreux types cellulaires
  (cellules nerveuses, hématopoïétiques,).
• La modulation de ces signaux peuvent donc
  affecter la différenciation, la prolifération,
  lapoptose des cellules. Notch est un inhibiteur
  de la différenciation de nombreux types
  cellulaires
• math-1, ngn3 modulent la différenciation. Ces
  facteurs sont contrôlés par Notch
• Rôle du signal Notch dans la différenciation et
  la prolifération des cellules précurseur dans
  lintestin

7
stratégie

• Création de souris transgéniques
• Expression dune forme constitutivement active de
  Notch
• Utilisation du promoteur de la villine la forme
  constitutivement active de la villine est
  présente dans toutes les cellules intestinales y
  compris dans les cellules souches.

8
Effet sur la différenciation(cellules en gobelet)

• Coloration au bleu cyan
• Cellules en gobelet

9
Effet sur la différenciation(cellules endocrine)

• Marquage de la chromogranine A
• (Marqueur général des cellules endocrines)

10
conclusion

• Lexpression de Notch entraîne la déplétion de
  cellules en gobelet et des cellules
  enteroendocrines

11
Notch et cryptdine
wt
Notch
Lexpression constitutive de Notch inhibe
lexpression de cryptdine et donc la
différenciation des cellules de Paneth
12
Donc

• Lexpression de notch constitutivement active
  provoque la déplétion des cellules sécrétrices
• À rapprocher du résultat suivant
• la surexpression de NICD (partie
  intracelllulaire de Notch) dans des souris
  transgéniques entraîne blocage de la
  différenciation des cellules sécrétrices.

13
Notch et facteurs de transcription
wt
Notch
Lexpression constitutive de Notch entraîne la
surexpression de Hes-1, la sous-expression de
Math-1 et de Ngn3
14
Notch et Hes-1localisation de Hes-1

• Notch augmente la concentration nucléaire de hes-1

wt
notch
15

• La surexpression de notch entraîne la déplétion
  des cellules sécrétrices en modulant lexpression
  des facteurs de transcription.

stem cell
Notch
Math1 -hes1
Cellules sécrétrices
?
?
ngn3
cellules de Paneth
cellules en gobelet
16
Statut dautres facteurs de transcription regulés
par notch

• Hes5, Hey-1
• Pas deffet de notch sur ces facteurs

17
Effet de notch sur la prolifération

• Selon le contexte cellulaire, la signalisation
  Notch peut influencer la prolifération
  cellulaire.
• Quen est il dans lintestin?

Ki67
wt
Notch
18
Effet de notch sur la prolifération
Brdu (marquage 30 sacrifice 24 heures après)
wt

• Notch

19
Conclusion
Notch augmente le nombre de cellules qui
prolifèrent (Expansion du compartiment de
prolifération) Pourquoi en Wt y a til des
cellules Brdu dans la villosité)?
20
Notch et morphologie
wt
Notch
Notch diminue le nombre de microvillosités au
niveau du domaine apical
21
WT
Notch
Microvillosités moins uniformes et moins
rigides Ressemble a des cellules immatures,
faiblement différenciées
22
conclusions

• La signalisation Notch semble importante dans
  lintestin et particulièrement dans les cryptes.
• Notch empêche la différenciation en modulant
  lexpression de Hes-1, ngn3,
• Elle maintient létat indifférencié et
  prolifératif des cellules des cryptes
• Interrelations avec dautres voies ( voie wnt)
  voir TD2

23

• Différenciation des cellules de Paneth

24
(No Transcript)
25
Cellules de Paneth

• Cellules sécrétrices (lysosyme, cryptdines,
  defensines)
• Cellules localisées dans les cryptes
• Elles achèvent leur différenciation lors de leur
  migration dans la base des cryptes.

26
De la cellule souche à la cellule de Paneth
MORT (autophagie)
Différenciation
Tris (rester dans les cryptes)
Spécification (secretion)
Auto-renouvellement
Cellule souche
27
Différenciation des cellules sécrétrices
stem cell
-Math1 Hes1
Math1 Hes1
Cellules sécrétrices
Cellules absorbantes
?
?
ngn3
cellules de Paneth
cellules en gobelet
cellules endocrines
28
Hes-1-deficient mice show precocious
differentiation of paneth cells in the small
intestineSuzuki et al., 2005Biochem Biophys
Res Commun328 (2005) 348-352
29
introduction

• Hes-1, facteur de transcription (régulé par
  Notch)
• souris déficientes en Hes-1 différenciation
  excessive des cellules endocrines (pancréas)
• Utilisation de souris KO pour Hes-1 étude du
  role de Hes-1 sur la différenciation des cellules
  de Paneth.
• Utilisation des souris juste après la naissance.
  A ce stade, il nexiste pas de cellules de Paneth
  dans les intestins de souris normales

30
Expression du lysosyme et des cryptdines dans les
intestins murins

• RT-PCR semi quantitative

31
conclusion

• Lysosyme augmentation des ARNm dans lintestin
  des souris KO Hes1
• Idem pour les cryptidines -1, -4, -5
• Hes1 module négativement lexpression des
  marqueurs de cellules de Paneth

32
Expression de marqueurs in situHes1

• Hes-1 pas de Hes-1 dans les cellules Ko pour
  cette molécule.

33
Expression de marqueurs in situlysosyme

• Lysosyme positive cells
• Villus intervillous
• WT 0 0,03
• Ko 0,8 0,49

34
Expression de marqueurs in situcryptdine-4

• cryptidine positive cells
• Villus intervillous
• WT 0 0,21
• Ko 2,7 0,82

35
conclusions

• Cellules difficilement détectables dans les
  souris normales
• Augmentation de lexpression dans les souris
  hes1 KO
• Développement précoce de cellules de paneth dans
  les souris KO
• Hes1 a un effet inhibiteur sur la différenciation
  des cellules de Paneth
• Présence des cellules de Paneth dans les
  villosités Hes1 jouerait un rôle dans la
  distribution des cellules (tri)

36
Microscopie electronique
WT
KO

• Souris KO Hes1 présence de cellules contenant de
  nombreux granules (cellules de Paneth)

37
Expression de Ki67
WT
KO

• Ki67 présence dans les cellules progénitrices
  capables de proliférer.

Hes1KO présence de cellules progénitrices dans
la villosité. Hes1 module la localisation des
cellules progénitrices
38

• Les souris déficientes en Hes-1 possédent une
  différenciation précoce par rapport aux souris
  normales.
• Hes1 joue un role inhibiteur dans la
  différenciation des cellules de Paneth

39
Différenciation des cellules de PanethAutres
voies impliquéesEphB/ephrinB

• ephB(récepteurs)/ephrinB(ligands)
• ephB récepteurs à tyrosine kinase
• Leur interactions implique des interactions
  cellule-cellule répulsion des cellules.
• Variation dexpression des ephrines dans laxe
  crypte/villosité
• Mutation dune ephrinB

40
Marquage du lysosyme

• EphB/ephrinB contrôle la localisation des
  cellules de Paneth.

41
Différenciation des cellules dePaneth

• Autres voies de signalisations impliquées Wn
  t

42
La voie Wnt

• En absence de voie wnt, la b-caténine est
  associée a un complexe ubiquitinilation et
  dégradation
• lactivation de la voie wnt inhibe le complexe,
  la b-caténine est stabilisée, transloquée dans le
  noyau. Interaction avec les facteurs de
  transcription TCF transcription de gènes
  spécifiques.

43
Implication de la voie wnt dans lintestin

• Dans les cellules qui prolifèrent, il y a
  accumulation de b-catenine nucléaire et de Tcf4
  forte signalisation wnt
• Lactivation de la voie wnt entraîne la formation
  dadénomes

44
Wnt signalling induces maturation of Paneth cells
in intestinal crypts

• Van Es et al. Nature cell biology (2005) 7.
  381-386
• Utilisation dembryon de souris TCF-
• Analyse de lexpression des marqueurs de cellules
  de Paneth

45
Localisation de TCF4 et de b-caténinedans
lintestin normal
b catenin
Tcf 4
46
conclusion

• Les noyaux des cellules de Paneth contiennent
  une accumulation de b-catenine et de Tcf-4 la
  voie wnt est sans doute impliquée.

47
Hybridation in situ
WT
WT

• WT si les cellules de Paneth ne sont pas
  morphologiquement observables dans les embryons,
  certaines cellules expriment des cryptdines
• Ko TCF pas dexpression de cryptdines

48
conclusion

• Souris normales expression de cryptdines
• Souris Tcf4- perte dexpression des cryptdines
• Tcf4 participe à la différenciation des cellules
  de Paneth

49
La voie Wnt

• Différents récepteurs Frizzled
• Frizzled 5 et frizzled 6 sont fortement exprimés
  dans lintestin normal.
• fz6 dans toutes les cellules épithéliales sauf
  les cellules de Paneth
• Et fz5?

50
Localisation de frizzled 5
embryon
adulte

• Frizzled 5 est localisée uniquement dans les
  cellules de Paneth
• Activation de la voie wnt via activation de Fz5?
• Souris mutantes pour Fz5

51
Localisation du lysosyme
Ko FZ5
WT
Les cellules de Paneth sont distribuées de façon
aléatoire le long de laxe crypte-villosité si
Fz5 mutée. Fz5 participe à la localisation des
cellules de Paneth.
52
Et lEphB/ephrineB?
Souris FZ5-

• Les cellules de Paneth mal positionnées
  nexpriment pas ephBQui est un gène cible de
  Tcf4
• Fz5 activerait la voie wnt , qui activerait
  lexpression de eph B qui permet le
  positionnement des cellules de Paneth dans les
  cryptes.

53
b-catenine
Souris Fz5-

• La b-catenine nucléaire est absente des cellules
  de Paneth mal positionnées
• Fz5 activerait la voie wnt , la beta catenine
  transloque dans le noyau et interagit avec Tcf4.
  Cela activerait lexpression de eph B qui permet
  le positionnement des cellules de Paneth dans les
  cryptes.

54
Frizzled 5
Positionnement Des cellules de Paneth dans les
cryptes
Expression de Eph B