La culture de cellules animales, quosse

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La culture de cellules animales,quosse ça donne?

• Alain Garnier, Université Laval

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Plan

• La culture de cellules animales
• Quest-ce?
• Pourquoi?
• Comment?

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Quest-ce?

• Différentes sources
• Différents types
• techniques de transformation
• Caractéristiques générales

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Sources

• Insectes
• Poissons
• Mammifères
• Humains

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Formes/tissus

• Épithéliales/endothéliales (membranes)
• Fibroblastes (tissus connectifs)
• Myoblastes (muscles)
• Neurones (syst. nerveux)
• Hepatocytes (foie)
• Erythrocytes (sang)
• Lymphocytes (syst. immunitaire)

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Formes...
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Types

• Culture primaire Culture initiale de cellules
  qui viennent dêtre prélevées dun tissu.
  Différenciée. Généralement à attachement
  obligatoire (ADC).
• Culture secondaire Propagation dune culture
  primaire. Création dune lignée cellulaire. Peut
  être cultivé en suspension. Peut être
  indifférencié. Durée de vie limitée (30-50
  divisions).
• Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire
  transformée. Peut être cultivée en suspension.
  Durée de vie illimitée.

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Transformations

• Naturelles
• Chimiques
• Virales
• Dirigées

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Différentes lignées

• MRC5, W138 secondaires, fibroblastes, poumons
  humains, adhérentes, vaccins
• HeLa cancer cervical humain (Helen La...),
  stable, adhérentes, recherche
• CHO ovaire de hamster chinois, stable,
  adhérente/suspension, versatile
• Vero reins de singe verts africains, stable,
  adhérente, versatile
• Sf9, Spodoptera frugiperda, stable, système
  dexpression baculovirus
• 293 embryon de rein humain, transformée par
  fragment dadénovirus, stable, hôte dadénovirus,
  adaptée à la suspension (293S)

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Exemple lhistorique de la mise en culture des
293
Graham, et al., J. Gen. Virol., 3659-72, 1977
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Caractéristiques générales

• Capable dexocytose
• Ne sécrète pas denzymes
• Modifications post-traductionnelles
• Introns/épissage (splicing)
• Besoins nutritionnels complexes
• Grande taille (10-20 ?m), pas de paroi
• Sensible au contraintes hydrodynamiques
• Temps de division lent (approx. 1 jour)
• Densité cellulaire faible

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Modification post-traductionnelle

• Clivage
• Pont S
• méthylation, phosphorylation, glycosylation
• conformation
• ajout de ligands spécifiques (lipid anchor)

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Glycosylation
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Introns/Exons, Epissage (splicing)
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Pourquoi?

• Pour létude
• Pour la production
• Vaccins
• Protéines thérapeutiques
• anticorps
• agents immunologiques
• Hormones
• Tissus
• Vecteurs viraux
• Cellules souches

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34 des nouveaux médicaments sont produits en
culture de cellules de mammifères
de médicaments approuvés ou en essais cliniques
en 2000 (Odum, Pharma. Eng., 2001)
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Les anticorps
Les anticorps sont des protéines produites par le
système immunitaire pour réagir avec un antigène
donné. Ce sont des molécules de 150kDa, composées
de 2 paires de polypeptides, lune de 25kD
(chaîne courte, domaine variable), lautre de 50
kDa (chaîne longue, domaine constant). La chaîne
courte est responsable de la spécificité de
lanticorps pour son antigène
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Production danticorps monoclonaux
MAb
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Anticorps monoclonaux - applications

• 37 des nouvelles molécules thérapeutiques
  biologiques
• Identification/diagnostic
• Thérapeutique
• Contre cancer, Crohn, Asthme, SIDA, etc.
• Dirigés contre une protéine spécifique, ils
  peuvent bloquer une interaction récepteur-ligand
  ou déclencher une réponse immunitaire.
• Ils peuvent aussi être liés à un agent
  chemothérapeutique, radioactif ou autre pour
  augmenter leur effet.

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Autres protéines

• Erythropoïétine (EPO, traitement de lanémie)
• Hormones de croissance
• Transforming Growth Factor (TGF)
• Epidermal Growth Factor (EGF)
• Nerve Growth Factor (NGF)
• Anovulants
• Cytokines (Interleukine, interféron, etc)
• Agents coagulants (Facteur viii),
  anti-coagulants, etc

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Interleukin 4
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Exemple Agent anti-angiogénétique (Laboratoires
Aeterna)
Le processus de langiogénèse, soit la formation
de nouveaux vaisseaux, joue un rôle important
dans le développement de la tumeur cancéreuse.
Certains agents peuvent inhiber ce processus. Les
agents isolés par Aeterna proviennent de
laileron de requin. La prochaine étape consiste
à isoler les gènes responsables de la synthèse de
ces agents et de les cloner dans des cellules
animales.
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Production de vaccins
Influenza
Herpes
Adenovirus
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Thérapie génique
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Maladies traitées
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Vecteurs utilisés
Rétrovirus
Adénovirus
La thérapie génique consiste à traiter une
maladie par le transfert de matériel génétique.
Les virus sont particulièrement bien adaptés pour
accomplir cette tâche.
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Culture de tissus

• Cellules de peau (Hopital du Saint-Sacrement,
  Laboratoire d'organogénèse expérimentale)
• Reconstruction de la moëlle épinière (Organogel
  inc.)
• Organes (foie, cœur, cerveau, etc)
• Cellules souches

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Comment?

• Caractéristiques générales
• Capable dexocytose
• Ne sécrète pas denzymes
• Modifications post-traductionnelles
• Introns/épissage (splicing)
• Besoins nutritionnels complexes
• Grande taille (10-20 ?m), pas de paroi
• Sensible au contraintes hydrodynamiques
• Temps de division lent (approx. 1 jour)
• Densité cellulaire faible

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Exemple de milieu de culture Dulbecco Modified
Eagle medium (DMEM)

• Sels (mg/L)
• CaCl2 200.00
• Fe(NO3)3.9H2O 0.10
• KCl 400.00
• MgSO4 97.67
• NaCl 6400.00
• NaHCO3 3700.00
• NaH2PO4.H2O 125.00
• Acides aminés (mg/L)
• Arginine 84.00
• Cystine.2HCl 63.00
• Glutamine 584.00
• Glycine 30.00
• Histidine 42.00
• Isoleucine 105.00
• Leucine 105.00
• Lysine.HCl 146.00
• Méthionine 30.00
• Phenylalanine 66.00

• Méthionine 30.00
• Phenylalanine 66.00
• Serine 42.00
• Thréonine 95.00
• Tryptophane 16.00
• Tyrosine.2Na.2H2O 104.00
• Valine 94.00
• Vitamines (mg/L)
• Ca.pantothénate 4.00
• Chlorure de choline 4.00
• Acide folique 4.00
• Inositol 7.20
• Niacinamide 4.00
• Riboflavine 0.40
• Thiamine.HCl 4.00
• Pyridoxine.HCl 4.00
• Autres (mg/L)
• Glucose 4500.00
• Rouge de phénol 15.00

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Sensibilité aux contraintes hydrodynamiques
problème doxygénation ou dagitation

• Pourtant les besoins en O2 des cellules animales
  ne sont pas si élevés

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Les cellules animales ne supportent que de très
petites contraintes hydrodynamiques, ce qui fait
en sorte que toutes sorte dindice de sévérité de
lagitation on été proposés
Integrated Shear Factor (Sinskey)
Taille du plus petit tourbillon (Théorie de
Kolmogoroff)
Vitesse du plus petit tourbillon
Concentration en plus petit tourbillon
TCS Turbulent collision severity (Cherry et
Papoutsakis) ICS Impeller collision severity
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Plusieurs géométries de bioréacteurs ont été
proposées

• différentes formes dagitateur
• marine
• ruban hélicoïdal
• voiles
• gazosyphon
• lits fluidisés
• transfert de gaz par tube de silicone
• enrichissement en oxygène

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Agitateur voiles
Lit fluidisé
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Division lente, faible densité

• Facilement contaminable
• une bactérie prendra facilement le dessus
• Nécessite des conditions d'asepsie très strictes
• Faible rendement en produit
• produit à haute valeur ajoutée
• produit qui ne peut être synthétisé dans dautres
  systèmes d expression
• Recherche de moyens pour augmenter la densité
  cellulaire...

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Au niveau cellulaire le mécanisme de débordement
glutamine
NH3
GLUCOSE
PYRUVATE
glutamate
TCA cycle,
OU
lactate
resp. chain
GLUTAMATE
glucose
pyruvate
NH3
GLUTAMINE
-Ljunggren and Haggstrom, Biotechnol. Bioeng.,
44 808-818, 1994 (Hybridoma)
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Au niveau du procédé

• Loptimisation du milieu prend du temps, mais
  permet de faire de grandes économies
• La cuvée alimentée peut permettre daugmenter la
  densité cellulaire dans le cas dun substrat
  inhibiteur ou dun produit inhibiteur dont la
  production dépend de la concentration en
  substrat.
• Le chemostat ou la perfusion vont permettre une
  augmentation de la densité cellulaire et de la
  productivité, mais avec un coût plus élevé en
  milieu de culture

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Au niveau du bioréacteur

• Microporteurs (poreux ou non)
• Micro-capsules
• Fibres creuses
• Rétention des cellules (perfusion)
• Spin-filters (intra ou extra bioréacteur)
• centrifugeuse en continu
• Sonosep

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Microporteurs
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Exemple Un filtre rotatif intra- bioréacteur,
combiné à un aérateur
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Fibres creuses
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Centrifugeuse en continu
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Sonosep séparation acoustique
Sortie
Entrée
Vidange
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Conclusion

• La culture de cellules animales est coûteuse et
  complexe.
• Elle ne doit être utilisée que pour produire des
  molécules qui ne peuvent être obtenues autrement.
• Elle permet alors de synthétiser des produits à
  très haute valeur ajoutée