PowerPoint-presentatie

1
Praktische Oefeningen MEDISCHE BIOCHEMIE
Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Apr. Ruben t
Kindt Apr. Michael Storme Apr. Julie De Smet Mr.
Wim Goeteyn Laboratorium voor Medische
Biochemie en Klinische Analyse
2
Overzicht

• Doel
• Algemene richtlijnen
• Technieken
• Uit te voeren proeven

3
Doel
bepaling van endogene componenten in
een biologische matrix... Bloed Urine
Punctievocht Etc. Serum / Plasma
Complicatie vele andere, gelijkaardige
componenten aanwezig dikwijls in veel ??
conc. ? nood aan SELECTIVITEIT SENSITIVITEI
T om pathologische toestanden op te sporen
en/of te bevestigen
4
Bloed
5
(No Transcript)
6

• Bepaling van
• een targetcomponent
• creatinine, bilirubine, ureum, cholesterol...
• een enzymactiviteit
• Alkalische fosfatase, LDH,

7

• Bepaling van een targetcomponent
• Algemene strategie
• Monster ontdooien
• ? mengen !
• Deproteïniseren hogere structuren van
  proteïnen
• H2SO4, TCA, EtOH
• Centrifugeren

8

• Supernatans bovenstaande vloeistof
• moet steeds HELDER zijn!
• Spectrofotometrie Fluorimetrie
• - na chemische kleurreactie
• bilirubine, glucose colorimetrisch
  Phenylalanine
• - na enzymatische omzetting
• glucose enzymatisch

9

• Bepaling van een enzymactiviteit
• ? bepaling van targetcomponent
• uitvoering op speciale spectrofotometers
• rekening houden met chemische structuur
• Michaëlis-Menten !!!!
• meestal kinetische bepaling
• - overmaat substraat toevoegen
• - hoev. substraat afgebroken/ tijdseenheid
• of hoev. product gevormd/ tijdseenheid
• ? spectrofotometrisch volgen
• - enzymactiviteit berekenen

10
Reactie- snelheid
0de orde overmaat substraat bepalen van
enzymactiviteit
Conc. Substraat
1ste orde overmaat enzyme bepalen van
substraat (targetcomponent)
11
Algemene Richtlijnen
Stalen
!! steeds HOMOGENISEREN omzwenken niet
schudden

• 1 plasmastaal (? 9 mL)
• gedurende volledig practicum bewaren
• onmiddellijk na gebruik in de ijskast
• niet in de zon laten staan
• zilverpapier rond staal zelf meebrengen
  (bilirubine breekt af o.i.v. licht)

12

• 1 bloedstaal ? hematologie

STEEDS op de dag zelf ter beschikking
gesteld Opmerking Handschoenen!
13
(No Transcript)
14

• Centrifuges
• STEEDS symmetrisch vullen
• Indien nodig evenwicht door toevoegen van een
  buis water
• STEEDS centrifugeerbuizen merken!

? ? ? ? ?
? ? ? ?
15

• Reagentia
• Standaarden
• meestal 1 per groep
• correcte concentratie gebruiken in de berekening
• nooit voorspoelen met standaardoplossingen
• contaminatie vermijden!
• ijskast!
• Producten aan weegschaal
• droog houden deksels op potten!!
• Vloeibare reagentia
• flessen afsluiten met juiste stoppen ?
  contaminatie!
• Kits zuinig zijn!! (LDH en glucose enzymatisch
  slechts 1x uitvoeren)

16

• Verslagen
• Geen papieren verslagen meer
• Resultaten in SI-units (zie omrekeningstabel,
  bijlage 2)
• Resultaten in computer ingeven, LOGIN en PASWOORD
  worden samen met staal geleverd.

17

• Algemeen - Milieu - Veiligheid
• Proper werken - s Avonds opruimen (trekkasten,
  microscopen!)
• GEEN jassen, GEEN boekentassen
• LABOJAS verplicht
• VEILIGHEIDSBRIL
• NIET met de mond pipetteren (peer)
• MILIEU!!! GEEN reagentia in wasbakken (ook niet
  vanuit cuvetten), enkel in afvalvaten

18

• Voorbereiding
• Dagelijks ondervraging mogelijk
• Zowel schriftelijk als mondeling
• Geen examenproef, dus GOED WERKEN
• Resultaat practicum telt voor 25 mee in het
  eindresultaat van het opleidingsonderdeel
  Medische Biochemie !!!!

19
Technieken

• Spectrofotometrie

20

• Spectrofotometrie
• Lichtstraal van bepaalde energie ( E? 1/? ) die
  door een oplossing wordt gestuurd zal met de
  moleculen van die oplossing interactie vertonen.
• ? De buitenste electronen van de moleculen
  worden door de EMS naar een hogere
  energietoestand gebracht.
• ? Intensiteit lichtstraal daalt.

dI
I0
Intensiteit
I
Afstand
21

• - dI ? I0 met
• ? N
• via mathematische afleiding Wet van Lambert-Beer
• I0
• E log ? . M . l
• I
• E extinctie
• ? molaire extinctiecoëfficiënt
• M molariteit v/d oplossing
• l weglengte

I0 oorspronkelijke intensiteit N
absorberende deeltjes / cm2 doorsnede
22
Spectrofotometer schematisch -
onderdelen 1. lichtbron (UV, of zichtbaar) 2.
golflengteselector 3. cuvet (glas,plastiek of
quartz) 4. intensiteitsmeter (fotogevoelige
cel) - meestal 2 schaaluitdrukkingen T en
E E log 1 / T
I0
1 2 3 4
23
Doel Concentratiemetingen 1. met 1 bekende
en een onbekende 1-puntscalibratie Ex ?
Cx Ex Cx Est
? Cst Est Cst 2. met reeks bekenden en
onbekende ijklijn
Ex . Cst Est
?
?
Cx
E4 E3 E2 E1
y ax b
Ex
C1 C2 C3
C4
Cx
24
Proeven

• Medische achtergrond
• Praktische aspecten

25
HEMATOLOGIE

• RBC of erythrocyten
• Aantal
• WBC of leucocyten
• Aantal
• Leucocytaire formule

26
RBC
Anemie
Polycythemie
RBC en/of Hb ?
RBC en/of Hb ?
27
WBC

• Onmisbare rol in het afweermechanisme
• Pathologie
• Leucopenie Leucocytose
• WBC lt 4000 WBC gt
  10000

• ? Differentiatie ? leucocytaire formule
• Vb. granulocyten lt 1000/ µL ??
  infectiegevaar ?

28
Praktisch

• VOLBLOED de dag zelf ter beschikking
• Tellen RBC
• Telkamer van Bürker 2 kamers per draagglas
• Hayemopl. bevat HgCl2 (GIFTIG)
• Leucocytaire formule
• Geen dekglaasje, maar een dr. immersie-olie
• Microscopen
• Lenzen ev. schoonmaken met xylol
• Voorwerpglaasje NIET raken met lens

29
UREUM

• Degradatie van ANZ ? afsplitsing a-NH2-groep
• ? trans- of de-aminatie-reactie
• Elk metaboliserend weefsel produceert NH4 ?
  toxisch

30
Praktisch

• Proefbuizen afsluiten met knikker ? bediende
• TIMING!!!

31
BILIRUBINE

• Hb (MW 64450)
• Tetrameer 4 HEEM groepen 4 GLOBINE ketens
• Drager van O2
• Biodegradatie Hb (lever)
• Splitsing in heem en globine
• Proteïnedeel ? proteïne-catabolisme
• Heem ? bilirubine ? glucuronidatie (gal) ? darm
  faeces
• urine

32
Geelzucht of icterus
Hyperbilirubinemie opstapeling bilirubine t.g.v.
levercelbeschadiging obstructie van de galafvoer
Praktisch

• Bilirubine lichtgevoelig ? zilverpapier
• Enkel totaal bilirubine wordt bepaald
• Diazo II en diazoreagens zelf maken
• Ijklijn zie p. 37

33
CREATININE

• Creatine glycine arginine methionine
• belangrijke spierconstituent
• Fosfocreatine spieren in rust
• ogenblikkelijke E-leverancier voor
  spiercontracties
• cycliseert spontaan tot creatinine
• Creatinine nutteloos afvalprodukt
• uitscheiding door nier
• Creatininemie ? o.a. nierinsufficiëntie

34
Praktisch

• Creatinine stockstandaard ? frigo
• ? nog verdunnen
• MIN. 1u incuberen
• Alk. picraatreagens vlak voor gebruik bereiden
• Natriumtungstaat natriumwolframaat

35
ELEKTROFORESE

• -samenstelling van de EW
• Albumine
• Diverse globulines (o.a. ? -globulines ?
  immunologische reflex)
• ? afwijking indicatie pathologie
• Scheiding gebaseerd op differentiële migratie
  van geladen EW in een elektrisch veld (zie ook
  item in Webcourse)

Praktisch

• Let op elektroforesekamer in werking ? 220V
• reagens om strips op te lossen is sterk
  zuur ? peer

36
GLUCOSE

• De onmiddellijke E-bron bij uitstek voor de
  cellen
• bij overmaat start glucose consumptie
• glycogenese, glycolyse, lipogenese
• bij tekort start glucose productie
• gycogenolyse, gluconeogenese, interconversie
• dirigenten insuline glucagon
• Diabetes Mellitus of suikerziekte
• basisdefect ?? insuline
• biochemisch hyperglycemie
• glycosurie
• ketogenese en acidose
• ? klinische symptomen

37
Bepalingen

• Hexokinasemethode meest specifieke methode
• glucose enzymatisch
• hexokinase
• glucose glucose-6-P
• ATP ADP
• G-6-fofaat-DH
• glucose-6-P NADP 6-fosfogluconaat NADPH
  H
• NADPH ? spectrofotometrisch van NADP
• Slechts 1 X per student
• TIMING
• glu gt 500 mg/dL opnieuw met 1/2 verdunning
  van supernatans

38

• Colorimetrische methode Somogyi-Nelson
• glucose colorimetrisch
• ? van eiwitten
• kleurvorming gebaseerd op reducerende
  eigenschappen
• arsenomolybdaat-reagens giftig, gebruik
  dispenser
• glu gt 500 mg/dL opnieuw met 1/2 verdunning
  van supernatans

39

• ENZYMACTIVITEITSBEPALINGEN
• Frequent uitgevoerd in het klinisch labo
• Soorten plasma-enzymen
• Plasma-specifieke
• Niet-specifieke enzymen van cellulair
  metabolisme

conc plasma gt conc cellen specifieke
functie aanmaak in lever conc plasma ? bij
leverdeficiëntie
specifieke voor weefsel of orgaan conc plasma ??
bij celbeschadeging vb. ADH in levercellen
40
Alkalische fosfatase (ALP)

• Opsporing van o.a. lever- en botafwijkingen
• p-nitrophenylfosfaat
  p-nitrophenol
• Absorbtie van p-nitrophenol bij 405 nm
• WWB 30C
• Opletten bij 37 C denatureert ALP!

Praktisch
Niet te lang!
41
(No Transcript)