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INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA
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NOTICIAS
A Través de la Ingeniería Genética es Posible
Hacer Crecer la Acuicultura en Chile Santander y
sus colegas de investigación introducen una
bacteria genéticamente modificada en una larva.
Utilizan bacterias ya que éstas poseen la
capacidad de colonizar los tejidos linfoides del
pez, es decir, la matriz de su aparato
inmunológico. Previamente, y gracias a la
Ingeniería Genética, eliminan las propiedades
patógenas de la bacteria y expresan antígenos a
fin de que el sistema inmunológico del pez logre
generar anticuerpos.
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CONCEPTOS

• INGENIERÍA GENÉTICA
• Disciplina científica relacionada con la
  manipulación de genes, deriva de la biología
  molecular.
• Herramienta fundamental
• Técnica del ADN recombinante

• BIOTECNOLOGÍA
• Uso o alteración industrial de organismos,
  células o moléculas biológicas.
• Lleva a la práctica las investigaciones
  realizadas por la Ingeniería Genética

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Cómo se recombina el ADN en la naturaleza?
El ADN se recombina naturalmente mediante los
procesos de Reproducción sexual Transformación
bacteriana Infección viral - transducción
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AÑO DESCUBRIMIENTO
1960s - 1970s Aislamiento de enzimas de restricción y su uso para el análisis de DNA
1972-73 Técnicas de clonamiento de DNA desarrolladas por H. Boyer, S. Cohen, P. Berg y otros en USA. En 1973 se clona el primer gen procarionte
1974 Expresión en bacteria de un gen heterólogo
1975-77 Desarrollo de métodos de secuenciación DNA. F. Sanger et al. (Inglaterra) A. Maxam y W. Gilbert (USA). En 1977 se obtiene la primera secuencia de un genoma completo. Se trata del fago F X174 que tiene 5375 bases.
1978 Clonamiento en bacterias de genes sintetizados químicamente somatostatina humana e insulina humana. 
1980 La corte Suprema en USA reglamenta que los microorganismos pueden patentarse
1982 La Insulina (Eli Lilly's Humulin) es el primer producto de la ingeniería genética que es introducido al mercado en USA e Inglaterra
1981/2 Producción de los primeros animales transgénicos (ratones)
1983 Primeras plantas transgénicas
1985 Primeros animales transgénicos (conejos, cerdos y ovejas)
1986 Introducción experimental y controlada al medio ambiente de organismos modificados genéticamente
1989 La Oficina de Patentes de USA anuncia que otorgará patentes a plantas y animales modificados genéticamente. Primer animal transgénico patentado es "oncomouse" de DuPont's
1990-92 Producción de maíz y trigo transgénicos
1992 Se establecen regulaciones en USA y EC para organismos modificados genéticamente
1992 Primera secuencia completa de un cromosoma (crom. III de levadura)
1994 Introducción al mercado de USA del primer tomate modificado genéticamente.
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TÉCNICAS UTILIZADAS EN INGENIERÍA GENÉTICA

• 1. Transferencia de genes de una
  especie
  a otra a través de plásmidos o virus.
• 2. Técnica de la PCR

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TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
El ADN puede cortarse en fragmentos por medio de
las enzimas de restricción. Cada enzima de
restricción reconoce una secuencia específica
de nucleótidos y corta en ese punto cada una de
las cadenas de ADN. Estos fragmentos quedan con
unos extremos o bordes cohesivos, también
llamados bordes pegajosos, que hacen que se
puedan unir fragmentos de distinto origen,
formando un ADN llamado recombinante.
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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN COMUNES
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Inserción de los
fragmentos de ADN i) PLÁSMIDOS
                                                

                     
Vectores de clonación moléculas de ADN que
tienen la capacidad para autoreplicarse dentro de
la célula hospedadora.
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ii) BACTERIÓFAGOS
                                                                                          

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iii) CÓSMIDOS
Son plásmidos que poseen un borde cohesivo
procedente del fago lambda y se empaqueta en el
interior de un fago.
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Métodos de introducción del vector1.
Transformación2. Transducción
                                                
                                                  
                                
                                                
                                                  
                              
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Clonación de un gen
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Mapa de restricción del vector pBR322. Presenta
dos genes marcadores (resistencia a amplicilina y
resistencia a tetraciclina)
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El siguiente paso es poner a las bacterias en un
medio de cultivo apropiado para que se
multipliquen. A la vez que se reproducen las
bacterias lo hace también el plásmido con el gen
que interesa, el resultado es que se obtiene un
clon de células que llevan ese gen de interés
Se pueden formar diferentes clones con genes de
interés para el hombre. Este conjunto de clones
se denomina biblioteca genómica.
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Además del origen de replicación, los vectores de
clonación deben llevar otros genes denominados
marcadores, que sirven para identificar las
células que contienen el vector de clonación. Se
suelen utilizar como marcadores, genes de
resistencia a antibióticos y genes de
bioluminiscencia.

• Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para
  identificar bacterias que contienen el vector de
  clonación, porque estas bacterias serán
  resistentes al antibiótico del gen marcador.
• Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula
  que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá
  la propiedad de emitir luz, ya que el marcador
  que se le incorpora determina que se exprese esa
  característica. Este sistema se emplea cuando la
  célula hospedadora es una célula eucariota.

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Plantas que se iluminan En la transfección vegetal con Agrobacterium se ha ensayado un marcador inusual el gen de la enzima luciferasa, de las luciérnagas. El sustrato de esta enzima es una proteina llamada luciferina, que con ATP y oxígeno desprende luz. Plásmidos Ti con este marcador, se transfirieron a células de tabaco, con las que se formaron nuevas plantas. Las nuevas plantas obtenidas se regaron en la oscuridad con agua y luciferina disuelta. El resultado fue sorprendente las plantas se iluminaron como si fuesen unas bombillas de poca potencia o un dibujo de un anuncio fluorescente.                                                       
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Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR)
Es una técnica que permite analizar rápidamente
la secuencia de un gen a partir de una pequeña
muestra de material biológico. Mediante esta
técnica pueden generarse millones de moléculas
idénticas, a partir de una molécula de ADN.
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ETAPAS PCR 1. Calentar el ADN a altas
temperaturas que pueden ser próximas a la
ebullición (1 minuto a 94 ºC) . Cada una de estas
cadenas actuará como molde para fabricar su
complementaria.
2. A continuación se baja la temperatura para
conseguir que cada cebador se una a su región
específica dentro de la cadena de ADN (45
segundos a 54 ºC).
3. Generación de la cadena de ADN complementaria
por acción de la ADN polimerasa
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• La reacción es un proceso cíclico
• La molécula de ADN que va a copiarse se calienta
  entre 94 y 96 ºC para que se desnaturalice y se
  separe las dos hebras.
• Se baja la temperatura entre 55 y 65 ºC
  durante 20 a 30 segundos para que el primer o
  cebador añadido pueda aparearse con la hebra de
  ADN.
• Cada una de las hebras es copiada por la
  ADN-polimerasa a 72 ºC (Se utiliza la
  ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas
  termales, Thermus aquaticus, así la enzima puede
  trabajar a altas temperaturas).
• Las cadenas recién formadas son separadas de
  nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de
  copias. Estos ciclos se repiten hasta que se
  obtiene el número de copias deseado.

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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
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APLICACIONES DE LA PCR 1) Secuenciación
Una de las razones mas comunes para el uso de la
PCR es la formación de suficiente cantidad de ADN
molde para su secuenciación. Es mucho mas
sencillo y rápido que la clonación en células.
2) Estudios evolutivos Mediante la PCR se
pueden amplificar genes de organismos ya
extintos, como del mamut, o restos antiguos
humanos. Se pueden comparar estos genes con los
genes semejantes de organismos actuales y poder
reconstruir árboles filogenéticos. El PCR
también se ha utilizado para conseguir el mapa
del genoma humano.
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3) Huellas dactilares del ADN. La
determinación de las huellas dactilares genéticas
constituye una de las aplicaciones más
interesantes de la PCR. Mediante esta técnica es
posible comparar muestras diferentes de ADN para
comprobar si pertenecen al mismo individuo o no,
o si existe parentesco entre ellas. Esta
técnica se aplica actualmente en Medicina forense
e investigaciones policiales, con el fin de
identificar individuos a partir de muestras
biológicas, como sangre, semen, piel o cabellos.
También se utiliza en las pruebas de paternidad.
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La huella dactilar de ADN, también conocida como
análisis del perfil de ADN, se basa en el uso de
la técnica de transferencia e hibridación de
Southern para analizar regiones polimórficas del
ADN humano. Pasos
1. Extracción del ADN Se puede extraer ADN de
casi cualquier tejido humano. Las posibles
fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen
sangre, semen, tejido de una víctima muerta,
células del folículo capilar y saliva. El ADN
extraído de las pruebas del delito ("indicios" o
"vestigios" biológicos) se compara con el
extraído de muestras de referencia, obtenidas de
personas conocidas, habitualmente de la sangre. 
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2. Digestión del ADN con una endonucleasa de
restricción El ADN extraído de la muestra se
trata con una endonucleasa de restricción, que es
una enzima que corta el ADN bicatenario en donde
tenga una seuencia característica. La enzima que
se usa más frecuentemente para el análisis legal
es HaeIII, que corta el ADN en la secuencia
5'-GGCC-3'. 
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3. Electroforesis en gel de agarosa Tras la
digestión del ADN, los fragmentos de ADN
resultantes se separan según su tamaño mediante
electroforesis en geles de agarosa. Durante la
electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen
carga negativa, migran hacia el electrodo
positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su
velocidad de migración se ve reducida por la
matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores
se mueven más deprisa a través de los poros del
gel que las de mayor tamaño. Como resultado, se
produce una separación continua de los fragmentos
de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los
fragmentos más pequeños avanzan la mayor
distancia con referencia al origen o punto de
aplicación de la muestra.
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PROCESO DE ELECTROFORESISSe prepara una mezcla
de fragmentos de ADN y se ponen en distintas
soluciones. Los fragmentos se desplazan en
relación inversa con su tamaño
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MOVIMIENTO DE TROZOS DE ADN
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Animacion electroforesis en gel de agarosa
http//biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/ele
ctrof2.html
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TEST aplicado a un varón, una mujer y sus cuatro
hijos/as. Cuál de los hijos/as es, el que con
menor probabilidad, desciende de esta pareja?
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Esta figura muestra la parte significativa de la
autorradiografía de un análisis, con sonda de
locus único, de varias muestras de ADN
procedentes de la investigación de una violación.
Las muestras de ADN se cargaron en las calles del
gel de este modo 1. Muestra de sangre de la
víctima. 2.- Muestra de sangre del acusado. 3.-
Marcadores de tamaño de ADN. 4.- Fracción
femenina de la muestra vaginal de la víctima.
5.- Fracción masculina de la muestra vaginal de
la víctima. Si Ud. fuera el analista de ADN,
debería sacar como conclusión A. El sospechoso
es culpable. B. El sospechoso podría ser
culpable, pero deben usarse más sondas. C. La
muestra vaginal procede de una víctima errónea.
D. El sospechoso queda excluido como origen del
ADN presente en la prueba del delito. E.
NINGUNA de éstas.
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D. El sospechoso queda excluído como origen del
ADN presente en la prueba del delito. La banda
superior de la calle 5 (la fracción masculina de
la muestra vaginal) no se corresponde con ninguna
de las bandas de la calle 2 (la muestra del
acusado), lo que permite descartar a éste como
origen de aquel ADN. - Es la correcta.
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OBTENCIÓN DE VACUNAS RECOMBINANTES
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Diagnóstico de enfermedades de origen genético.
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Técnicas indirectas usadas en la
agricultura 1.- Técnicas indirectas
transformación por Agrobacterium tumefaciens
2.- Técnicas directas - Electroporación
- Microinyección, - Liposomas - Otros.
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Técnicas indirectas usadas en la agricultura
Transformación de células mediada por
Agrobacterium tumefaciens.
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Hojas en plantas expresando el antígeno de la
hepatitis B
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Electroporación. Proporciona un pulso eléctrico
que permeabiliza la membrana celular, permitiendo
la incorporación de moléculas como proteínas y
DNA.
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PLANTAS TRANSGÉNICAS
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Equipo para biobalística utiliza
microproyectiles cubiertos con DNA, los que son
acelerados en una cámara, disponiéndose sobre la
base las células a clonar.
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? Aplicaciones en animales

• Estudiar la función de genes específicos.
• Poder utilizar a mamíferos como biorreactores
  para la producción de proteínas humanas.
• La corrección de errores innatos de metabolismo
  mediante terapia génica.
• La transgénesis se puede efectuar por
• Microinyección de cigotos
• Manipulación de células embrionarias

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CLONACIÓN DE ANIMALES

• POR TRANSFERENCIA NUCLEAR

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Clonación de oveja
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OBTENCIÓN DE UNA CERDA TRANSGÉNICA
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Se combinó el gen de la hormona de crecimiento
somatotropina humana con la porción reguladora de
un gen de ratón y se inyectó en óvulos fecundados
de ratón. Los ratones transgénicos resultantes
crecieron hasta el doble del tamaño normal,
indicando que el gen humano se había incorporado
al genoma del ratón y estaba produciendo hormona
de crecimiento. Dado que el DNA se había
inyectado en los óvulos, apareció en todas las
células, incluyendo las células germinales, y así
pudo ser transmitido a la generación siguiente.
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Un borrador inicial del genoma fue terminado en
el año 2000 (anunciado conjuntamente por el
presidente Bill Clinton y el primer ministro
británico Tony Blair el 26 de junio,
2000) Proyecto terminado en abril del 2003
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Mapas genéticos
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Mapas físicos Secuenciación de ADN por ordenador
con letras y colores.
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Por qué esta magnífica tecnología científica,
que ahorra trabajo y nos hace la vida mas fácil,
nos aporta tan poca felicidad? La repuesta es
está, simplemente porque aún no hemos aprendido
a usarla con tino. Albert Einstein
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