GEN TEDAVISINE GENEL BAKIS

1
GEN TEDAVISINE GENEL BAKIS

• Dr. Eren ÇETIN
• Osaka Universitesi Gen Tedavisi Bilimi

2
Gen Tedavisinde Amaç

• Bozuk genetik yapinin saglikli kopyasi ile
  degistirilmesidir.

3
Ilk Gen tedavisi (1990- Dr Anderson) Retrovirus
ile T hücrelerine iki ayda bir Adenozin deaminaz
(ADA) nakli. Ilk Faz III Klinik çalisma
(1990) Beyin Kanseri tedavisinde Retrovirus ile
Herpes Simplex TK gen nakli
4
Plasmids for expression in mammalian cells have
the same building plan
www.genhunter.com/ products/aptag-3/
5

• Gen tedavisinde ilk klinik basari (2000-Alain
  Fischer Paris ) SCID-X1 çocuklarda bildirildi.
• Gen tedavisinde ilk Faz II klinik basari (2000)
• Bas-Boyun adenokarsinomu
• oncolytic adenovirus ile GT ve kemoterapi
• 2001 FDA/NIH onayli 500. GT klinik çalisma

6

• 2003 ilk GT ticari ürünü (Çin) lisans aldi..p53
  geni tasiyan adenovirus vektorü
• Mart 2004 FDA/NIH onayli 619 GT klinik çalisma
• 405 (65) kanser
• 58 ( 9) monogenic hastalik (17 farkli
  genetik hastalik, -
  SCID, hemophilia, and cystic fibrosis )
• 40 ( 6) enfeksiyoz hastalik ( HIV gibi)
• 69 (11) diger (peripheral artery disease and
  coronary - -
  artery disease)
• 47 ( 8) for marker or non-therapeutic
  trials.
• 3000 den fazla hasta GT klinik çalismada yer
  aldi.

7
Gen Tedavisinde Basamaklar

• Bozuk genetik yapinin tespiti
• Hedef doku lokalizasyonunun tespiti
• Saglikli genetik yapinin klonlanmasi
• Saglikli genetik yapinin hedef dokuya
  ulastirilmasi

8
Ideal Gen Tedavisi

• Klonlanmis saglikli genlerin, tedavide yan etki
  ve komplikasyonunun olmamasi
• Bu genlerin sentez, vektor ve hücre içi ortaminda
  bozulmamasi
• Bu genlerin hedef hücrenin genetik yapisini
  etkilememesi
• Bu genlerin hücre içi ortaminda veya mitoz
  sonrasinda ekspresyonunun bozulmamasi
• Kullanilan vektor veya yontemin canliya veya
  hedef dokuya zararinin olmamasi
• Hedef doku disinda normal dokularin enfekte
  edilmemesi

Gerekir
9
Genlerin Hedef Hücrelere Aktarimi

• Fiziksel Yontemler Verimsiz ve Kisitli
  fonksiyonel
• Dogrudan hedef dokuya DNA enjeksiyonu
• Katyonik Lipozomlar
• Balistik Gen enjeksiyonu Altin veya Tungsten
  1-3 µm
• parçaciklar plazmit DNA ile kaplanir,
  hizlandirilarak hücre zari delinir.

10
Lipozomlar
Why naked DNA?
Lets wrap it in something safe to increase
transfection rate
Lipids is an obvious idea !
DNA Plasmids
11
http//www.iskweb.co.jp/hvj-e/english/cation.jpg
12
Genlerin Hedef Hücrelere Aktarimi

• Fiziksel Yontemler 2 Verimsiz ve Kisitli
  fonksiyonel
• Elektroporasyon
• Sonikasyon
• Kalsiyum Fosfat
• Polibrene/Dimetilsulfoksid
• Diethil aminoetil dekstran
• Glikoprotein-DNA bileskeleri

13
Genlerin Hedef Hücrelere Aktarimi

• Biyolojik Vektorler
• Genetik olarak zararsiz hale getirilmis virüsler
• Bu virüsler içine yerlestirilmis
  rekombinant saglikli genler,
• hedef hücre çekirdek içi veya
  disinda protein sentezine katilir
• Retrovirüs (enfeksiyon hizi düsük, hücre DNAsi
  içine girmekte)
• Kas, endotel,
  Karaciger
• Adenovirüs (immunolojik yan etkiler) Trakea,
  endotel, oculer
• Herpes virüs (sitotoksik etkiler)
• Adeno assoc. virus (gen kabul etme ve tasima
  kapasitesi düsük)
• HSV-1 , Polio Virus, Parvo Virus, Sindbis Virus

14
EN SIK KULLANILAN VIRAL VEKTÖRLER
Retroviruses
Adenoviruses
Adeno-associated viruses
Herpes simplex viruses
15

Retroviral transfer Integration receptors!!!
"minimal" retrovirus
contains
Env Gag Pol
POL reverse transcriptase RNA?DNA
http//users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyP
ages/R/
16
Retroviral vectors are able to infect dividing
cells only
Preintegration complex of retroviruses non able
to penetrate nuclear membrane.
In dividing cells nuclear membranes are broken
down, so viral genome can enter and integrate
into the chromosome
Infection of dividing cells only
Good for cancer gene therapy
Nevertheless, retroviruses are most often used
vectors for common disease gene therapy and for
gene expression studies
Every therapeutic construct should include safety
features
17
Lentiviral vectors
Lentiviruses are retroviruses that can infect
both dividing and nondividing cells
Preintegration complex of lentiviruses can get
through the intact membrane of the nucleus of
the target cell.
Able to infect nondividing or terminally
differentiated cells such as neurons,
macrophages, hematopoietic stem cells, retinal
photoreceptors, and muscle and liver cells
Example of lentiviruses HIV-1 (infects T-helper
cells) AIDS.
Good feature no immune response!
18
ADENOVIRUSES
non-enveloped viruses containing a linear double
stranded DNA genome
40 serotypes known most producing respiratory
infections in humans
subgroup C serotypes 2 or 5 are predominantly
used as vectors
can infect both dividing and nondividing cells
12 antenna-like fiber projections for virus
attachment
www.nobel.se
19
Problems with adenoviral vectors
1. Cannot integrate with the host cell genome
expression from adenoviral vectors is always
transient
2. Large size

pAdeno-X also contains a pUC-derived
replication origin (pUC ori) and ampicillin
resistance gene (Ampr) for propagation and
selection in E. coli.
Or go through TRANSFER vectors with transposon
aid
in vivo hepatic gene delivery to hemophilia B
dogs.
20
Adeno-associated virus (AAV)
Can be ideal as
-- does not stimulate inflammation in the host
-- does not elicit antibodies against itself
-- can enter non-dividing cells -- integrates
successfully into one spot in the genome of its
host (on chromosome 19 in humans).
21
Vector tropism can be improved pseudotyping,
bi-specific antibodies to redirect to an
alternate receptor and by genetic engineering of
fiber proteins
www.medther.gla.ac.uk
22
(No Transcript)
23
Genlerin Hedef Hücrelere Aktarimi

• Biyolojik Vektorler
• Sendai Virus (HVJ) mouse influenza virus
• envelope protein HN Sialic acid
  reseptorlerine baglaniyor
• envelope protein F membran
  kolesterolune baglaniyor
• In vivo fare KC/kas hucrelerinde gen ekspresonu
  14/30 gun
• pEB ile .35/120 gun
• Gene therapy for Critical limb ischemia (CLI) due
  to arteriosclerosis obliterans or thromboangitis
  obliterans (Buerger's disease) Fibroblast growth
  factor 2 (FGF-2)
• EBV replicon plasmid (latent viral
  DNA-replication sequence-OriP ve EBV nuclear
  antigen1-EBNA1 içeriyor)

24
Genlerin Hedef Hücrelere Aktarimi

• Ex vivo Hedef hücreye gen aktarimi yüksek, Kemik
  iligi için ideal
• In vivo Gen transferi düsük
• cDNA aktarimi (tedavi geni içerir, virusler ile
  tasinir)
• Antisens Oligonukleotid (DNA veya mRNA parçacigi
  kopyasi)

25
Gen Tedavisinde Sorunlar

• Kisa süreli etkinlik
• Immün reaksiyonlar
• Gen kontrol ve targeting sorunlari
• Multigen hastaliklar (Kanser, kalp hastaliklari,
  Hipertansiyon, Diyabet, Artrit, Alzheimer Hast.
• Finans ve Etik sorunlar

26
(No Transcript)
27
(No Transcript)
28
(No Transcript)
29
(No Transcript)
30
(No Transcript)
31
(No Transcript)
32
TESEKKURLER