Diapositive 1

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Impact des radiations UV sur les communautés
cyanobactériennes
Modèles détude
Synechococcus sp. WH8102
Prochlorococcus MED4

• Abondants dans les eaux mésotrophes et
  oligotrophes
• Distribution verticale peu abondant lt 100 m
• Ecotype pélagique
• Génome disponible
• Manipulable génétiquement

• Abondants dans les eaux oligotrophes
• Concentration souvent gt a 105 cell.ml-1
• Distribution verticale de 1 à 100 m
• Ecotype de surface
• Génome disponible

Approches

• Etudier leffet des UV sur la photosynthèse, le
  cycle cellulaire et la réparation des dommages
• à lADN dans différentes conditions de culture.
• Identifier de nouveaux gènes impliqués dans la
  résistance aux UV (Gel 2D, Microarrays).
• Mise au point de marqueurs du stress UV
  applicables en milieu naturel.

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Participants pour la Station Biologique de Roscoff

• Samuel Chaffron (MST, Mise en place du
  Turbidostat)
• Alexis Dufresne (Thèse, Bioinformatique)
• Chistophe Six (Thèse, Protéomique)
• Ludovic Chopin (DEA, Biologie Moléculaire)
• Julia Holtzendorff (Post doc, Biologie
  Moléculaire)
• Dominique Marie (IE, Cytométrie en Flux)
• Laurence Garczarek (CR1, Biologie Moléculaire)
• Jean-Francois Lennon (CR1, Physicien)
• Fredéric Partensky (DR2, Coordinateur)

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Expériences Prévues dans le Cadre dUVECO

• Cyclostat en lumière jour-nuit modulée (PAR
  UVA UVB)
• Microarrays Complet et/ou miniarray (environ
  150 gènes)
• Gènes photosynthétiques Centres Réactionnels,
  Phycobilisomes, Synthèse des pigments
  (chlorophylle, caroténoides), Gènes de stress
  lumineux (HLIP)
• Réparation des dommages à lADN
• Antioxydants
• Protéines Heat shock
• Systèmes à deux composants
• Transcription/Machinerie régulatoire
• Fixation du carbone
• Intégrité membranaire
• Synthèse protéique
• Expérience de shift ou acclimatation de
  Synechococcus à différentes lumières (UVA, B)
• Genétique sur Synechococcus (Mutants ponctuels,
  librairies de mutants)
• Biosenseur en temps réel (utilisant le gène recA
  ?)

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Construction du Cyclostat
MILIEU DE CULTURE
Pompes péristaltiques
UVA, UVB
PRELEVEMENTS
PAR
CULTURE
POUBELLE
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Construction du Cyclostat
MILIEU DE CULTURE
Bain circulant Thermostaté
Pompes péristaltiques
Prélèvement automatique des échantillons
CULTURE
POUBELLE
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Paramètres étudiés à partir du Cyclostat

• Cytométrie en Flux
• Croissance et cycle cellulaire
• Formation intracellulaire de composés doxygène
  réactifs ?
• Gels 2D
• Identification de protéines différentiellement
  exprimées
• PCR Quantitative
• Expression de différents gènes impliqués dans la
  photosynthèse, la photoprotection, le cycle
  cellulaire et la formation de dommage à lADN
• Microarrays (Mise en évidence de nouveaux gènes
  impliqués dans la résistance aux UV)
• Péroxydation des lipides membranaires (dosage a
  lacide thiobarbiturique)
• Dosage des groupements -SH (C. Six)
• Composition pigmentaire (HPLC,
  spectrofluorimétrie, C. Six, F. Lantoine)
• Variation des paramètres photosynthétiques (P.
  Conan) ?
• Dommages à lADN (dosage des CDPs, F. Joux)
• Modifications biochimiques (sucres, acides
  aminés, R. Sempéré)

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Volumes prélevés et fréquence des prélèvements
sur le cyclostat
Méthodes d'analyses
Volumes Prélevés Cytométrie en Flux (D. Marie)
Croissance, cycle cellulaire,
2 x 1 ml Espèces réactives
de l'O2 toutes les 30 min Analyse
pigmentaire (C. Six, F. Lantoine) HPLC
3 x 50 ml Spectrofluorimétrie 1.5
ml Mycosporines ? Paramètres
photosynthétiques (P. Conan) ? ARN (L.
Garczarek)
Microarrays PCR Q 700
ml Gels 2D (C. Six)
2 ou 3 points/jour Exp
indép Groupements SH (C. Six)
? Dimères de thymidine/ Protéines
carbonylées (F. Joux)
? Dommages lipidiques (C. Six ou F. Joux)
? Malondialdehyde Modificati
ons Biochimiques (R. Sempéré) ?
Sucres, acides aminés
1500
Growth irradiance (µE.m-2.s-1)
750
0
Time
Points de prélèvement 6h, 9h, 12h, 15h, 18h, 22h,
2h
Volume Maximum prélevé 900 ml/ point
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Calendrier récapitulatif
2003
2004
2005
2006
9
(No Transcript)
10
(No Transcript)
11
(No Transcript)
12
Macroarray Gene Selection

• Model Synechococcus WH8102

• 2 Arrays Photosynthesis/Photoprotection/UV
  stress
• Small ORF in Synechococcus (lt 100
  Amino Acid)

• Structure Hybridization/Scanning
• Genopole Grand Ouest (Plateform of Rennes)
• Laboratory of Frédérique Hubler
• Bioinformatic/Statistic
  Treatment
• Genopole Grand Ouest (plateform of Nantes)

• Conditions First array limited to
  100-150 genes
• Oligonucleotide/PCR product ?
• ControlStress Cy3/Cy5

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• Photosynthetic genes Gene Name
• 1 photosystem II D1 protein form II psbA2
• 2 photosystem II D2 protein psbD1
• photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein
  subunit psaA
• Ia (PsaA)
• 4 photosystem II chlorophyll-binding protein
  CP43 psbC
• 5 photosystem II chlorophyll-binding protein
  CP47 psbB

Phycobilisomes
Phycoerythrin
Allophycocyanin
Phycocyanin
Stroma
CP47
CP47
D2
D2
Thylacoïdale Membrane
D1
PsaA
PsaB
CP43
D1
CP43
D1
Lumen
PsaI/L
PsaF/J
PsaM
CR II
CR I
Photosystem II
Photosystem I
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Pigment synthesis Gene
name 6 chlorophyll synthase 33 kD
subunit chlG 7 possible light-dependent
protochlorophyllide oxido-reductase pcr, por 8
light-independent protochlorophyllide reductase
subunit B chlB 9 lycopene beta
cyclase crtL 10 beta-carotene
hydroxylase crtR 11 carotenoid binding
protein or0312 12 possible beta-carotene
ketolase or0313 13 conserved hypothetical
protein or0315
Chlorophyll synthesis Carotenoids synthesis

DV-Protochlorophyllide a2
lycopene
lycopene ß cyclase
Protochlorophyllide reductase (or0544, or0545,
or0545)
Protochlorophyllide oxydoreductase (or0543,
or0791, or1537)
?-carotene
lycopene ß cyclase
ß-carotene
Chlorophyllide a2
ß-carotene hydroxylase
ß-cryptoxanthin
Chlorophyll synthase
ß-carotene hydroxylase
Chlorophyll a2
zeaxanthin