Prsentation PowerPoint

1
APPLICATIONS DES BIOPUCES EN BIOLOGIE ET EN
CLINIQUE
Bernard Mari
2

• 1. Puces dexpression (transcriptome)
• - Gènes différentiellement exprimés
• - Diagnostic/ Pronostic
• - Etudes dépissages alternatifs
• 2. Analyse du génome
• - Hybridation génomique comparative (CGH)
• - Détection de mutations (gène BRCA1) ou de SNPs
• - Détection dorganismes pathogènes
• - Séquençage
• 3. chIP-chip (Immuno-précipitation de la
  chromatine / caractérisation de promoteurs)
• 4. MicroRNAs

3
Les Puces dExpression
4
Analyse des gènes différentiellement exprimés
classification par profil dexpression (exemple
du cycle cellulaire)
1- Mieux comprendre le phénomène étudié en
identifiant les gènes impliqués et les
régulations mises en jeu 2- Impliquer des gènes
de fonction inconnue dans des voies biologiques
connues
5
Fish and Chips A Fast Track to Understanding
Blood Development
 Combination of using gene transcript microarrays
to identify candidates and producing antisense
molecules in zebrafi sh for functional screening
of these candidates offers a way to
quickly identify genes with central roles
in vertebrate development 
Eckfeldt CE, Mendenhall EM, Flynn CM, Wang TF,
Pickart MA, et al. (2005) Functional analysis of
human hematopoietic stem cell gene expression
using zebrafi sh. DOI 10.1371/journal.pbio.003025
4
6
Transcriptome et Cancer
7
(No Transcript)
8
Objectifs de ces études à grande échelle 1)
Nouveaux facteurs pronostics 2) Nouveaux
facteurs prédictifs 3) Nouvelles cibles
thérapeutiques
9
Le cancer du Poumon
La classification anatomo-pathologiste le
cancer du poumon est divisé en 4 grandes classes
le carcinome malpighien (25 à 40 des cancers
du poumon), ladénocarcinome (25 à 40 ), le
carcinome à petites cellules (20 à 25 ) et le
carcinome à grandes cellules (10 à 15) (15-17).
Dans certains cas, il s avère difficile de
classer les tumeurs. Ces analyses ont confirmé
l extrème degré de complexité concernant les
anomalies moléculaires dans ces cellules
(instabilité génétique très importante)
10
Grandes Cellules
Petites Cellules
Malpighien
Adéno Gr1
Adéno Gr2
Adéno Gr3
Normal
Lutilisation des puces a permis détablir une
nouvelle classification moléculaire qui pourrait
permettre de trancher pour certains cas
difficiles.
11
De plus, certaines signatures moléculaires
corrèlent avec un comportement métastatique et/ou
la survie des patients.
Bair E, Tibshirani R (2004) Semi-supervised
methods to predict patient survival from gene
expression data. DOI 10.1371/ journal.pbio.002010
8
12
Problème Majeur en Cancérologie lextrème
hétérogénéité des tumeurs, ce qui complique
lanalyse
1) Nombreuses zones de nécrose 2) Infiltration
par de nombreuses cellules normales  qui
composent le  stroma  Composition
fibroblastes, myofibroblastes, cellules
endothéliales, leukocytes, ...
13
(No Transcript)
14
Microdissection dun échantillon dAdénocarcinome
Avant
Après
Echantillon microdisséqué
Tumeur
Plèvre
(LCM Arcturus Pix Cell II)
15
Traitement de léchantillon
Microdissected sample
RNA Isolation
RNA Amplification (2X)
In Vitro Transcription (aaUTP)
CyDye Coupling
Hybridization scanning
16
Tumor
Normal
Ref
17
Diagnostic Pronostic Applications Cliniques ?
Agendia (Amsterdam) MammaPrint (pronostic
métastases, 70 gènes) Ipsogen (Marseille)
cancer profiler Affymetrix (partenariat avec
Roche, bioMérieux, Veridex) AmpliChip CYP450
Puce dexpression pose néanmoins de sérieux
problèmes dinterprétation dans les applications
cliniques
18
Epissage Alternatif ?
Alternative splicing events and probe location
for splice-array design
Fehlbaum, P. et al. Nucl. Acids Res. 2005 33e47
doi10.1093/nar/gni047 ExonHit (Paris), Splice
Arrays mais également Jivan (Trans Express
Arrays) et Affymetrix (exon-only array, 1 million
de sondes ...)
19
Analyse du Génome
20
Genetic Variation
21
Array-based Comparative Genomic Hybridization
22
Microarray (Resolution 1 Mb)
Traditional Resolution 5 Mb

Gains
Losses
Losses
Taken from Mehra, et al., 2002. Genes,
Chromosomes and Cancer. 33(2), 225-234
Gains
23
De plus en plus précis ...

• NimbleGen 385.000 spots (résolution de 6000 pb)
  avec la possibilité de zoomer sur une région
  particulière.
• - Agilent choix parmi 4 millions de sondes pour
  designer sa lame à haute résolution (max 40.000
  spots)
• Tiling arrays Affymetrix 6.5 millions de
  sondes, soit une résolution de 35 pb pour le
  génome humain !

Nature, Technology feature, Vols 435 (p991) and
437 (p1195)
24
Single-Nucleotide Polymorphism discovery (HapMap
Project)
25
SNP Arrays
Et aussi Illumina (1 million de SNPs)
26
Séquençage
Cycle1
Cycle2
The 1000 genome ?
Cycle3
Séquençage par synthèse (Solexa VisiGen)
27
Gene Chip for Viral Discovery
Viral Discovery and Sequence Recovery Using DNA
Microarrays Know your enemy. Description of the
virus gene chip that helped to classify the
SARS virus as a novel coronavirus.
Wang et al., PLOS BIOL, 1, 2003
28
Principe du ChIP on Chip
29
(No Transcript)
30
Etude des MicroRNAs
31
Puce  MIRs  - IPMC
Version 2  1K  plus de 1000 sondes
correspondant à lensemble des microRNAs isolés à
ce jour (release 7.0 miRNA registry, Sanger).
Protocole différent des puces dexpression
classiques par marquage direct au platine et
révélation par amplification enzymatique (Perkin
Elmer)
32
(No Transcript)
33
Lanalyse des Données
34
(No Transcript)
35
Normalisation Intra-Lame
Normalisation par les gènes de ménage / contrôles
exogènes Normalisation selon lintensité
totale Swap Lowess (Locally Weighted Scatter
plot Smoothing) est une méthode mathématique
basée sur le fait que la grande majorité des
gènes (plus de 90 ) n'est pas modulée lors dun
traitement quelconque (lissage robuste des ratios
par des régressions locales) Centrage
réduction les données brutes sont transformées
en logarithme. Afin de comparer plusieurs
expériences de puces à ADN, il est ensuite
nécessaire de réaliser une étape de centrage
réduction des données obtenues pour chacune des
expériences. Le centrage consiste à ramener la
valeur de la moyenne de la distribution de chaque
expérience à 0 pour les rendre comparables. La
réduction a pour effet de supprimer les effets de
variation entre les expériences en ramenant leurs
écart-types à la même valeur. Cette manipulation
prend comme hypothèse que la majorité des gènes
nont pas une expression modifiée au cours des
expériences. Shrunk Robust Splines, développée
par Gordon Smyth (Limma sous R). Cette fonction
est similaire à la normalisation par lowess mais
elle utilise une méthode de régression différente
des courbes de lowess (méthode Bayésienne).
36
(No Transcript)
37
(No Transcript)
38
Normalisation (suite)
A
Intra-lame LOWESS
B
Inter-lame Quantile
39
Analyse des Données

• Seuil fixe (Ratios gt 2)
• SAM (Significance Analysis of Microarrays)
  développé à lUniversité de Stanford. Ce
  programme détermine quels sont les gènes
  significativement modulés à partir de données
  répliquées. Le mode de sélection est basé sur
  lexpression différentielle des gènes, et
  également sur la reproductibilité des ratios au
  niveau des réplicats expérimentaux. Ce programme
  permet davoir une estimation du taux de faux
  positifs (False Discovery Rate) en fonction du
  nombre de gènes sortis de lanalyse

40

• Analyse en Composante Principale
• (ACP)
• - ANOVA (test de student)
• - deux groupes  cest le test T. Ce test
  calcule la probabilité p que deux groupes dun
  paramètre simple soient des membres dune même
  population.
• - plusieurs groupes  cest lanalyse de la
  variance (ANOVA). Ce test compare la distribution
  de deux groupes ou plus pour déterminer si un ou
  plusieurs des groupes est différent des autres.
  Le test ANOVA permet davoir une estimation de la
  contribution de chaque facteur intervenant dans
  les données de puces à ADN, et aussi de
  linteraction entre ces facteurs. Il permet
  également de donner statistiquement la
  significativité de ces contributions (p-values).

41
- Analyse sous  R  test statistique laide
dun score statistique dérivé dun modèle
linéaire utilisant une approche empirique
bayésienne.
42
 Consensus on a core set of statistical options
will likely emerge, as will agreement on data
quality standards. Applications will encompass
defining gene function inferring functional
networks and pathways understanding how
variation is distributed among individuals,
populations, and species and developing clinical
protocols relating to cancer prognosis and
detection of toxin exposure. Similar profi ling
methods for proteins and metabolites will attract
just as much attention as functional genomics,
building on the foundations laid by genome
sequencing