PCR-Methoden

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PCR-Methoden

• SSP- und SSO-PCR
• Guido Heymann

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PCR-Methoden

• PCR-SSPSequenzspezifische Primer erkennen
  einzelne Allele während der Amplifikation

• PCR-SSOSequenzspezifische Oligonukleotide
  erkennen einzelne Allele in einem zweiten Schritt
  nach der Amplifikation vorgegebener DNA-Abschnitte

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PCR-SSP(sequence specific primers)

• Genomische oder kodierende DNA eingesetzt
• Sense- und Antisenseprimer amplifizieren
  definiertes Stück DNA
• Ein Primer detektiert ein vorgegebenes Allel
  spezifisch, wenn am 3-Ende ein Basenmismatch
  vorhanden ist, findet keine Amplifikation statt
• Am Ende der Amplifikation ist eine direkte
  Auswertung z.B. über ein Gelbild möglich

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Prinzip der PCR-SSP
Genomischer DNA-Doppelstrang bei Erhitzung auf
gt92C denaturiert.
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Prinzip der PCR-SSP
Primerannealing bei 37 - 72C
5
Antisenseprimer
3
3
Senseprimer
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Prinzip der PCR-SSP
Primerannealing mit Basenmismatch
5
Antisenseprimer
3
Senseprimer Da Mismatch keine Elongation
3
5
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Prinzip der PCR-SSP
Elongation durch Taq-Polymerase bei 72C
Wiederholung Denaturierung, Annealing und
Elon- gation, bis PCR-Cyclen beendet.
5
3
3
5
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PCR-SSO(sequenz specific oligonucleotides)

• Genomische oder kodierende DNA
• Primerpaar amplifiziert größeres DNA-Stück, das
  spezifische Areale umfaßt.
• In einer Detektionsreaktion werden mittels
  spezifischer DNA-Sonden verschiedene Allele
  erkannt und in einer zweiten Reaktion dargestellt
  (Farbumschlag, radioaktiv...)

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Prinzip der PCR-SSO

• Dot-Blot-PCR-SSO PCR-amplifizierte Ziel-DNA wird
  auf Trägermedium immo-bilisiert spezifische
  Oligonukleotide werden stellenweise aufgetragen
  wo spezifische Anlagerung geschah, wird durch
  Reportermolekül Nachweisreaktion vermittelt.

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Prinzip der PCR-SSO
Reportermolekül mit Antikörper gegen DIG oder
Streptavidin radioaktiv oder enzymver- mittelte
Farbreaktion
Markiertes Oligonukleotid z.B. DIG,Biotin ......
Ziel-DNA
Auf Membran fixiert
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Prinzip der PCR-SSO

• Reverse-Dot-Blot-PCR-SSO Spezifische
  Oligonukleotide werden auf Trägermedium
  immobilisiert PCR-amplifizierte Ziel-DNA, die
  während der Elongation mit einem Labelmolekül
  versehen wurde, wird stellenweise aufgetragen wo
  spezifische Anlagerung geschah, wird durch
  Reportermolekül Nachweisreaktion vermittelt.

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Prinzip der PCR-SSO
Strepavidin- konjugiertes Reportermolekül macht
Bindung sichtbar (radioaktiv, enzymatisch..)
Ziel-DNA wird mit biotinmarkierten
Primern amplifiziert und dena- turiert auf die
Membran gegeben
SSO-Moleküle werden auf Membran immobilisiert (mit
Poly-T oder BSA)
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Prinzip der PCR-SSO

• PCR-Oligocapture sandwich assay Spezifische
  Oligonukleotide werden an Trägermedium
  immobilisiert und PCR-amplifizierte Ziel-DNA wird
  ansatzweise dazugegeben danach wird ein
  Oligonukleo-tid, das eine hochkonservierte Region
  erkennt, dem Ansatz hinzugefügt. Dieses Reporter
  SSO vermittelt die Nachweis-reaktion.

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Prinzip der PCR-SSO
Im letzten Schritt wird das Substrat, z.B.
O-phenylene- diamin, als Farbreaktion umgesetzt
Capture Oligo- nukleotid ist an Wand des
Reaktions- gefäßes fixiert
Detektionsoligo- nukleotid ist mit Enzym
gekoppelt, das Substratum- wandlung ver- mittelt
PCR-amplifizierte DNA bindet an fixiertes SSO
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Prinzip der PCR-SSO

• PCR-Dual phase Oligocapture assay In der
  flüssigen Phase wird die Ziel DNA während der PCR
  mit Digoxigenin markiert und ansatzweise mit
  biotinmarkierten SSOs hybridisiert. In der festen
  Phase wird diese Bindung in streptavidinbeschichte
  ten Reaktionskammern fixiert und über Anti-DIG-Ak
  als Reaktionsmittler die Bindung dargestellt.

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Prinzip der PCR-SSO
3 Das Gemisch wird in streptavidin- konjugierte
Wells einer Mikrotiter- platte eingefüllt.
5 Es findet eine enzymatische Farbreaktion statt.
4 Das Reportermolekül reagiert mit den an die DNA
konjugierten Labelmolekülen.
1 In der vorgeschalteten flüs- sigen Phase wird
die Ziel- DNA amplifiziert und mit speziellen
Molekülen, z.B. DIG, markiert.
2 Die Ziel DNA wird mit biotinylierten SSO-Sonden
hybridisiert.
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PCR-Fakten

• Die tatsächliche Effizienz der PCR liegt
  üblicherweise bei 70-80.
• Nach etwa 35 Zyklen wird ein Plateau erreicht
• Anstieg der Schmelztemperatur
• Reannealing in Konkurrenz zur Primeranlagerung
• Abnahme der Primerkonzentration
• Hitzestreß auf Taq-Polymerase (T1/2 bei 95C 40
  Min.)
• 3-5-Exonucleaseaktivität der Taq-Polymerase

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Reaktionsparameter

• PCR-Primer
• ab 18 nt Länge ausreichende Spezifität
• ab 28-30 nt keine Zunahme der Spezifität
• GC-Gehalt zwischen 50-60
• ähnliche Schmelztemperaturen
• Poly-T-Reste neigen zu unspezifischen Bindungen
• palindromische Bereiche führen zu
  Haarnadelbildungen
• Interprimerkomplementarität erzeugt Dimere

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Reaktionsparameter

• Desoxynukleosidtriphosphate
• pH 7,0
• Taq-Polymerase arbeitet bei niedrigeren
  dNTP-Konzentrationen genauer
• üblich 20-200µM je dNTP

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Enzymkonzentration

• Für 100 µl Ansatz 1 - 2,5 U Enzym
• Zu viel Enzym erzeugt Unspezifitäten
• Zu wenig Enzym verringert Produkt-ausbeute

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Andere Einflußfaktoren

• Qualität der DNA-Matrize
• PCR-Puffer
• Tris-HCL, NH³/KCL...
• Magnesiumchlorid
• über dNTP-Konzentration, da dNTPs Mg wegen
  negativer Ladung binden
• Auswirkung wie bei Enzymkonzentration

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PCR-Förderer und -Inhibitoren

• Glycerin erhöht T 1/2 von Taq-Polymerase
• DMSO löst störende Sekundärstrukturen der
  Matrize auf, hemmt Taq
• Heparin hemmt Taq-Polymerase
• EDTA kann Mg wegfangen
• Häm Fe hemmt Taq
• Detergenzien können PCR hemmen