MOLECOLE CHE POSSIEDONO GRUPPI IONIZZABILI

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• MOLECOLE CHE POSSIEDONO GRUPPI IONIZZABILI

nucleotidi
Acidi nucleici
Aminoacidi
proteine
ELETTROFORESI
Metodo di separazione basato sulla diversa
velocità di Migrazione di particelle cariche
sotto linfluenza di un Campo elettrico
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ELETTROFORESI
Migrazione di particelle cariche sotto lazione
di un campo elettrico. Tecnica soprattutto
ANALITICA ma anche PREPARATIVA. E un mezzo di
separazione molto potente, fra i piu usati in
biochimica

• Metodi FRONTALI - in soluzione libera
• Metodi ZONALI attraverso un mezzo poroso

Acetato di cellulosa
gel
carta
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UN METODO ANALITICO

• NUMERO di proteine presenti in una miscela
• GRADO DI PUREZZA
• PUNTO ISOELETTRICO
• PESO MOLECOLARE

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FATTORI CHE INFLUENZANO LA VELOCITA DI MIGRAZIONE

• Natura del supporto
• Campo elettrico applicato
• Caratteristiche della particella
• Massa
• Carica
• Dimensioni
• forma

m mobilità elettroforetica
m velocità di migrazione

V
E
Campo elettrico applicato
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NATURA DEL SUPPORTO

• assorbimento ritenzione di molecole da parte
  del supporto (coda)
• Elettroendosmosi per la presenza di gruppi
  carichi sulla superficie del mezzo di supporto
• Carta COOH
• Agarosio SO4-
• pareti di vetro Si-OH
• Filtrazione molecolare effetto setaccio

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CAMPO ELETTRICO APPLICATOVoltaggio Corrente -
Resistenza

• La differenza di potenziale tra gli elettrodi
  genera
• E V / d
• E gradiente di potenziale
• V voltaggio applicato
• d distanza fra gli elettrodi
• Intensità di corrente Voltaggio applicato /
  Resistenza

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• RESISTENZA

Aumentare della distanza fra Gli elettrodi

_
Aumenta la forza ionica del tampone Aumenta la
temperatura
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INFLUENZA DEL TAMPONE

• ha la funzione di mantenere le molecole del
  campione in uno stato di ionizzazione
• COMPOSIZIONE non deve legarsi ai composti da
  separare
• CONCENTRAZIONE da 0.05 a 0.10 M
• pH determina, influenza, stabilizza la
  velocità di migrazione
• RISULTATI RIPRODUCIBILI
• VOLTAGGIO O AMPERAGGIO COSTANTI

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CARATTERISTICHE DELLA PARTICELLACarica
dimensioni - massa

• A PARITA DI CONDIZIONI ELETTROFORETICHE
• Le molecole si separano sulla base del rapporto
• CARICA / MASSA

SUPPORTO
CAMPO ELETTRICO
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Un apparato per elettroforesi è costituito da

• ALIMENTATORE CAMERA ELETTROFORETICA
• Verticale
  Orizzontale
• SUPPORTO
• SOLIDO POROSO SU
  GEL
• (su carta da filtro o acetato di
  cellulosa) (poliacrilammide o
  Agarosio)
• Sulla base alla composizione del mezzo in cui
  avviene lelettroforesi
• Elettroforesi in condizioni native
  denaturanti - riducenti
• Isoelettrofocalizzazione (IEF)
• Elettroforesi bidimensionale
• Elettroforesi su gradiente

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ELETTROFORESI SU SUPPORTO
su carta
su gel
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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• GEL DI AGAROSIO
• usato per separare frammenti di DNA grandi (da
  500 bp a 20 Kb)
• GEL DI ACRILAMMIDE
• usato per separare frammenti di DNA piccoli (da
  1 nucleotide a 2 Kb) I FRAMMENTI DI DNA SI
  MUOVONO VERSO IL POLO POSITIVO
• AD UNA VELOCITA INVERSAMENTE PROPORZIONALE AL
  LOGARITMO DELLA LORO LUNGHEZZA(rapporto CARICA /
  MASSA è COSTANTE)

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ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMMIDE

• Utilizzata per la separazione di PROTEINE e di
  ACIDI NUCLEICI
• Il gel si ottiene dalla polimerizzazzione di
  molecole di ACRILAMMIDE e con la formazione di
  legami crociati in presenza di METILEN-BIS-ACRILAM
  MIDE
• Il processo di polimerizzazione è innescato
  dallaggiunta di TEMED (tetrametilendiammina) e
  persolfato
• GEL DI ACRILAMMIDE usato per separare frammenti
  di DNA piccoli ( da 1 nucleotide a 2 Kb)

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Formazione di un gel di poliacrilammide
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Rivelazione, stima quantitativa e recupero da gel
elettro-eluizione
densitometria a scansione
Comparison of the sensitivity achieved with
SYPRO, silver and Coomassie brilliant blue
stains. Identical SDS-polyacrylamide gels were
stained with A) SYPRO Orange protein gel stain,
B) SYPRO Red protein gel stain C) silver stain
and D) Coomassie brilliant blue stain, according
to standard protocols.
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ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTI (gel di
poliacrilammide in UREA)

• Separazione di frammenti di DNA
• UREA 7 M aggiunta al gel mantiene denaturati
• (a singolo filamento) i frammenti di DNA
• Gel lungo (fino a 50-60 cm) e sottile
• Ad alto voltaggio (circa 2000V)
• I frammenti migrano solo in base alla loro
  lunghezza
• DETERMINAZIONE DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICA

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(No Transcript)
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ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO

• Separazione ed analisi di campioni contenenti DNA
  o RNA
• Si scioglie lagarosio in polvere nel tampone in
  seguito ad EBOLLIZIONE della sospensione
• Dopo raffreddamento fino alla temperatura di 45C
  la soluzione si versa in uno stampo dove
  gelificherà
• Un pettine genera gli spazi per depositare i
  campioni
• Il gel viene immerso completamente nel tampone
• Migrazione orizzontale verso il polo positivo
  (anodo)
• separazione in BASE ALLA LORO MASSA poiché il
  loro rapporto CARICA / MASSA è costante

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La velocita di migrazione dipende

• 1) dalle dimensioni dei frammenti
• 2) dalla percentuale dellagarosio nel gel
• 3) dal voltaggio applicato.
• Frammenti lineari piu piccoli migrano piu
  velocemente rispetto a quelli piu grandi,
  mentre, a parita di peso molecolare, il DNA
  circolare migra piu velocemente di un DNA
  lineare, in quanto assume una conformazione detta
  super avvolta (super coiled DNA)

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Come si rivelano gli acidi nucleici?

• Colorazione con ETIDIO BROMURO (colorante
  fluorescente)
• Questo composto contiene un gruppo planare che si
  intercala tra le coppie di basi del DNA.
• il colorante viene quindi visualizzato irradiando
  con raggi U.V. (ad esempio con un
  transilluminatore) e fotografandolo su un film
  polaroid.
• la sensibilità del rilevamento è solitamente
  migliore di 0.1 mg di DNA.
• Dal momento che l'etidio è un agente
  intercalante, è un potenziale mutageno.

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(No Transcript)
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SOUTHERN BLOT
IMPRONTA DEL DNA basata sui polimorfismi di
sequenza cioè piccole differenze di sequenza
presenti in media ogni 500 1000 coppie di basi
e Diverse da individuo ad individuo (
polimorfismi della lunghezza dei frammenti di
restrizione o RFLP)
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ELETTROFORESI DI PROTEINEsu gel di
poliacrilammideLa porosità del gel dipende dal
rapporto ACRILAMIDE/BIS-ACRILAMIDE

• LA VELOCITA DI MIGRAZIONE DIPENDE
• Carica netta
• Dimensione
• Corrente applicata
• Dal valore di pH del tampone
• A pH fisiologici la maggior parte delle
  proteine è sotto forma di ANIONI (-)

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ELETTROFORESI IN CONDIZIONI NATIVE

• Permette di individuare un enzima o proteina per
  la sua ATTIVITA BIOLOGICA
• Le proteine conservano la loro carica nativa
• Separazione rapporto CARICA / MASSA
• nel gel è possibile incubare un substrato
  lenzima si lega e sviluppa un prodotto colorato
• PAGE al 7,5 in sistema refrigerato per evitare
  denaturazione

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ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTI SDS-PAGE
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• Le proteine si denaturano con molecole di SDS
  ogni due residui di Aminoacidi
• La carica nativa della proteina viene eliminata
  dalle molecole di SDS cariche negativamente
• SI ALLESTISCE
• Running gel matrice al 10 di PAGE in cui
  avviene la separazione
• Staking gel al 4
• TUTTE LE PROTEINE SONO CARICHE NEGATIVAMENTE
  (migrano verso lanodo)
• SEPARAZIONE BASATA SULLE DIMENSIONI
• (gel come setaccio molecolare)

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SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide
Gel Electrophoresis)
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(No Transcript)
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Effetto setaccio in un gel uniforme
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(No Transcript)
33
(No Transcript)
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• Fissaggio del gel in metanolo e acido acetico
• Colorazione con Blu di Coomassie
• Valutazione della PUREZZA DEI CAMPIONI
• DETERMINAZIONE DEL PESO MOLECOLARE rispetto a
  STANDARD DI RIFERIMENTO

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La mobilità di una proteina è direttamente
proporzionale al logaritmo decimale della MASSA
MOLECOLARE
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IEF ISOELETTROFOCALIZZAZIONE

• separazione di sostanze anfotere
• Separazione sulla base del pi
• GEL con GRADIENTE DI pH
• Si usano GLI ANFOLITI (elettroliti anfoteri)
• Sono miscele di acidi alifatici sintetici
  poliammino-policarbossilici che formano un
  gradiente di pH nella matrice prima della sua
  polimerizzazione
• Gli analiti migrano verso la zona di pH
  corrispondente al proprio punto isoelettrico
  (FOCALIZZAZIONE)
• E utile una CALIBRAZIONE con proteine a pi noto

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Il gradiente di pH e formato dall introduzione
nel gel di composti conosciuti come anfoliti,
che sono miscele complesse di acidi
poliammino-policarbossilici sintetici. Gli
anfoliti possono essere acquistati per diversi
range di pH, sia a banda larga (ad es. da pH 3 a
pH 10) che a banda stretta (ad es. da pH 7 a pH 8)
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(No Transcript)
39
(No Transcript)
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USO per separare forme isoenzimatiche e per
determinare il punto isoelettrico di una proteina
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(No Transcript)
42
MAPPA DI PROTEINE confronto tra normale e
malato SEQUENZIAMENTO di proteina da singola
macchia Analisi con SPETTROMETRIA DI MASSA
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(No Transcript)
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FOCALIZZAZIONE ISOELETTRICA
Unaltra tecnica, oltre alla cromatografia a
scambio ionico, che permette la separazione di
macromolecole sulla base della loro carica.
Estremamente potente
Catodo (-)
Anodo ()
? Miscela di anfoliti
Focalizzazione isoelettrica di alcune varianti
della stessa proteina, lemoglobina
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Trasferimento su un foglio di nitrocellulosa
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(No Transcript)
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Nel punto in cui è localizzata la proteina che
interessa si forma una banda Colorata-
Limmunoblot consente di identificare proteine
anche in quantità Molto piccole e di definire il
loro peso molecolare
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Una applicazione clinica del Western Blot
Viral Proteins HIV, like any other virus, is
composed of a number of different proteins. The
Western Blot positive control lane contains
proteins from patient sera as well as HIV
proteins. HIV positivity can therefore only be
confirmed by the presence of the following types
of proteins gp160 viral envelope
precursor (env) gp120 viral envelope
protein (env) binds to CD4 p24 viral
core protein (gag) p31 Reverse
Transcriptase (pol) Band pattern interpretation
In 1987 the Centers for Disease Control along
with several other organizations established
criteria for serologic interpretation of HIV
Western blot tests. The criteria are listed
below. No bands present
? Negative
Bands at either p31 OR p24 AND bands
present at either gp160 OR gp120 ? Positive
Bands present, but pattern does not meet
criteria for positivity
? Indeterminate


Lane 1, HIV serum (positive control) Lane
2, HIV- serum (negative control) Lane A,
Patient A Lane B, Patient B Lane C, Patient C
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Capillary Electrophoresis (CE)
Advantages of Capillary Electrophoresis High
separation efficiency (105 to 106 theoretical
plates) Small sample size required (1-10 ul)
Fast separation (1 to 45 min) Easy and
predictable selectivity Automation Quantitation
(linear) Reproducibility Couple to mass
spectrometer
Types of Molecules that can be separated by
Capillary Electrophoresis Proteins,
Peptides, Amino acids Nucleic acids
Inorganic ions, Organic bases, Organic acids
Whole cells
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• Fissaggio del gel in metanolo e acido acetico
• Colorazione con Blu di Coomassie
• Valutazione della PUREZZA DEI CAMPIONI
• DETERMINAZIONE DEL PESO MOLECOLARE delle proteine
  rispetto a STANDARD DI RIFERIMENTO
• Nellesempio la purificazione dellenzima RNA
  Polimerasi da E.Coli

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Elettroforesi di proteine in condizioni native
(A) Analysis of binding of the b subunit
cytoplasmic domain (bsol) to ECF1 and ECF1 (-).
Mixtures of polypeptides were first analyzed by
native agarose gel electrophoresis (A) through a
1 agarose gel. Lanes from left to right I,
ECF1 (-?) II, bsol III, ? IV, bsol ? V,
bsol (? 1-134) VI, bsol ECF1 (-?) VII, ?
ECF1 (-?) VIII, bsol ? ECF1 (-?) IX,
ECF1 (-?) (? 1-134) X, bsol ECF1 (-?) (?
1-134). (B) Bands were excised from the agarose
gel and separated on a 10-18 gradient of
polyacrylamide in SDS.
Rodgers et al (1997) J. Biol. Chem. 272 31058
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)