Anticuerpos policlonales, monoclonales y recombinantes' Sus aplicaciones

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Anticuerpos policlonales, monoclonales y
recombinantes. Sus aplicaciones
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Plegamiento de Inmunoglobulinas
3
Inmunoterapia

• Es el uso de células, moléculas y genes del
  sistema Inmune para tratamiento de enfermedades
  infecciosas, autoinmunidad, enfermedades
  tumorales y rechazo de injertos.
• La Inmunoterapia
• Pasiva involucra la administración de Igs en
  general, anticuerpos en particular, células,
  inmunoconjugados y generar un efecto terapéutico
  in situ.
• Activa moviliza el sistema inmune mediante la
  administración de vacunas o inmunomoduladores que
  aumentan la inmunogenicidad tanto de Ags
  endógenos como de Ags exógenos. Ambas están
  interrelacionadas, ya que la administración de un
  agente afectará varios circuitos inmunológicos.
  
•  

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Proteínas Inmunomoduladoras y antiproliferativas

• Interferones
• Anticuerpos monoclonales
• anti-CD25 (Rc IL-2) Basilimab
• anti-TNF Infliximab, Adalimumab.
• anti-CD3 Muromonab
• Construcciones Artificiales (Quimeras)
• LFA3-Fc de IgG humana
• (CTLA-4)-Fc de IgG humana
• DAB389-IL-2
• Rc de TNF-Fc de IgG humana

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Ejemplos de proteínas recombinantes de
importancia Farmacéutica
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Sitio de combinación del anticuerpo

• Uso de anticuerpos en terapia
• 1. Por qué el énfasis del uso de Acs. en terapia
  ?
• 2. Los Acs. pueden ofrecer un prolongado
  beneficio con un rápido efecto?
• Mayor logro de la Inmunoterapia

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Anticuerpo y Terapia

• Gran potencial en terapias
• Región variable unión al Ag
• Región constante función efectora y catabolismo
• Anticuerpos líticos y bloqueantes
• Rol del isotipo
• Naturaleza del Ag. blanco
• Especificidad
• Se conocen diferentes Ags asociados a tumores

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Usos de Fármacos en Patologías relacionadas con
el Sistema Inmune

• Enfermedades infecciosas
• Enfermedades tumorales
• Enfermedades autoinmunes

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Usos de Fármacos en Patologías relacionadas con
el Sistema Inmune

• Enfermedades infecciosas
• Seroterapia
• Vacunas
• Antibióticos
• Antivirales
• Vacunas recombinantes

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Usos de Fármacos en Patologías relacionadas con
el Sistema Inmune

• Enfermedades autoinmunes
• Moléculas químicas (inmunosupresores)
• Inmunosupresores azatioprina, methotrexate,
  cyclophosphamide, cyclosporina.
• Proteínas
• Inmunomoduladoras y antiproliferativas

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Usos de Fármacos en Patologías relacionadas con
el Sistema Inmune

• Enfermedades tumorales
• Moléculas químicas
• Moléculas proteicas
• Citoquinas
• Acs. Monoclonales
• Acs recombinantes

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Anticuerpos terapéuticos.

• Desde 1980 la Inmunoterapia ha sufrido una
  eclosión importante,
• Surgieron nuevas metodologías para la generación
  de moléculas recombinantes.
• A pesar de estos avances tecnológicos, la
  traslación de nuevas metodologías al ámbito
  clínico ha sido lenta y dificultosa.

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Aplicaciones Clínicas de anticuerpos

• Los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos son
  la terapia del futuro
• La afinidad de su interacción con el Ag y su
  larga vida media le permite competir con drogas
  sintéticas.
• Los Mabs han sido de gran importancia para
  definir la fisiopatología de numerosos procesos
  patológicos
• El uso de terapia de corto tiempo con Acs. para
  obtener un efecto modulatorio a largo plazo del
  sistema inmune es uno de los desafíos más
  exitantes del futuro de la terapia con Acs.
• En el área de terapia en cáncer se han obtenido
  en algunos casos resultados prometedores.

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Tipo de Anticuerpos

• Policlonales
• Monoclonales
• Recombinantes

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Comparación de Anticuerpos policlonales,
monoclonales y recombinantes
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Aplicaciones de Anticuerpos Monoclonales -Reacti
vos de uso in vitro -ELISA, Inmunohistoquímica,
Técnicas inmunoquímicas. -Purificación de
proteínas -Identificación y Aislamiento de
subpoblaciones celulares. Ej CD4 y
CD8 -Detección de tumores in vivo -En
terapia -Función efectora -Especificidad
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Inmunoterapia con anticuerpospara enfermedades
autoinmunes, mediante inoculación por vía
endovenosa

• Citopenias
• Trombocitopenia idiopática
• Anemia hemolítica autoinmune
• Neutropenia Inmune
• Coagulopatías
• Anticuerpos anti factor VIII
• Síndrome antifosfolipídico
• Vasculitis
• Enfermedades asociadas a anticuerpos ANCA
• Desórdenas del colágeno
• Lupus Eritematoso Sistémico
• Artritis Rematoidea
• Polimiositis

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Inmunoterapia con anticuerpospara enfermedades
autoinmunes, mediante inoculación por vía
endovenosa

• Enfermedades dermatológicas
• Pénfigo ampollar
• Enfermedades Neurológicas
• Miastenia Gravis
• Esclerosis Múltiple
• Polineuropatía crónica
• Enfermedades inflamatorias
• Enfermedad de Crohn
• Colitis Ulcerativa
• Enfermedades autoinmunes órgano específicas
• Diabetes Insulino dependiente
• Tiroiditis autoinmune
• NOTA A pesar que estas dos tablas indican
  tratamiento con Ig endovenosa para estas
  enfermedades, son muy pocos los éxitos
  descriptos.

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Comparación de las Características de los 3
tipos de anticuerpos

• 1. ESPECIFICIDAD
• 1.1-Ventajas. El epitope es el sitio particular
  de una mólécula de Ag al que se une un particular
  Ac. Típicamente está constituído por un pequeño
  número de aa o carbohidratos. Convencionalmente,
  un antisuero (anticuerpo policlonal) no sólo
  tendrá anticuerpos contra diferentes epitopes,
  sino que también una familia de Ac de diferente
  estructura y avidez que competirán entre si por
  el mismo epitope.
• Por lo tanto, pueden aparecer reacciones cruzadas
  entre Acs y proteínas que presentan epitopes
  estructuralmente similares.
• Esto se evita utilizando mAb que ha sido
  seleccionado por su habilidad de unirse a un
  determinado epitope.

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• La más refinada aplicación de la especificidades,
  por ejemplo, es la diferenciación de dos cepas de
  bacterias, virus, hongos, etc. para ser
  utilizadas en diagnóstico o con fines
  preparativos. Similarmente, dos hormonas que
  tienen una cadena común pueden ser diferenciadas,
  así como dos hormonas esteroides que se
  diferencian por un simple grupo químico.
• La alta especificidad de los mAbs reduce
  reactividades cruzadas no específicas, de tal
  manera, que pueden desarrollarse técnicas
  inmunohistoquímicas de máxima sensibilidad.
• El alto grado de especificidad que poseen los
  mAbs abren la posibilidad de ser utilizados en
  inmunoterapia tumoral, como molécula Ac sóla o
  acoplada a drogas o toxinas para el tratamiento
  de leucemias.

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• 1. ESPECIFICIDAD
• 1.2-Desventajas. Existen causas por las cuales un
  mAb puede ser menos preciso de lo esperado y por
  lo tanto presentar reacciones cruzadas.
• Primero, el epitope puede estar presente en otras
  moléculas no relacionadas.
• Segundo, la reacción cruzada puede ocurrir con
  mAbs que reaccionan con epitopes diferentes. El
  ejemplo de este fenómeno es una proteína de
  mieloma que se une a DNP-lisina y naftoquinona.
  Por lo tanto, el concepto que los mAb son
  monoespecíficos puede no ser correcto.
• Estas reacciones cruzadas pueden no afectar la
  mayoría de los usos de los mAbs. Sin embargo esto
  enfatiza la importancia de procedimientos
  orientados hacia una correcta selección.

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2-AFINIDAD

• 2.1-Ventajas. Puesto que cada epitope puede
  producir una serie de Acs de variable afinidad,
  es posible seleccionar un mAb con una constante
  de asociación determinada, descartando el resto.
  Esto tiene una gran ventaja en las metodolgías de
  radio y enzimoinmunoanálisis, ya que se requieren
  Acs de alta afinidad para obtener una máxima
  sensibilidad. Sin embargo, en algunos casos se
  requiere un Ac de baja afinidad, como en el caso,
  por ejemplo de la purificación de antígenos
  vulnerables a desnaturalización.
• La constante de asociación de un Ac
  monoespecífico es cuantificada mediante su
  relación entre sus constantes de asociación y
  disociación. Estos dos parámetros pueden variar
  independientemente de acuerdo a las condiciones
  experimentales. Por ejemplo, una K de 1010 l/mol
  puede reflejar una Ka de 105 l/mol/seg y una Kd
  de 105/seg o una Ka de 103 l/mol/seg y una Kd de
  10-7 /seg.
• 2.2-Desventajas. Es considerado que un mAb nunca
  puede reemplazar la alta afinidad de un suero
  policlonal, ya que en este participan los
  múltiples efectos cooperativos de los diferentes
  anticuerpos.

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• 3. AFINIDAD Y ESPECIFIDAD INTERRELACION
• Es evidente que la afinidad y la especificidad
  están estrechamente relacionadas. Es posible
  seleccionar un mAb que es altamente específico
  para un ensayo y presentar reacción cruzada en un
  ensayo altamente sensible. Por otro lado un mAb
  aparentemente no específico puede reconocer al
  epitope en cuestión bajo diferentes condiciones.
  Por lo tanto es muy importante el método de
  selección del mAb deseado.
• 4. ESTANDARIZACION
• Como reactivo estandard, es indudable que el mAb
  es superior al policlonal, ya que prácticamente
  imposible obtener cantidades ilimitadas de un
  antisuero con la misma afinidad para un
  determinado epitope.

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• 5. RENDIMIENTO Y PUREZA
• 6. REQUERIMINTOS DE PURIFICACION
• 7. SELECCION DEL ISOTIPO
• 8. COSTO
• 9. APLICACIONES DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES

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• 9. APLICACIONES DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES
• 9.1-PARA USO DIAGNOSTICO
• Los mAbs obtenidos en rata y ratón son los más
  frecuentemente utilizados. La mayor ventaja de
  los mAbs sobre los sueros convencionales es
  seguramente la posibilidad de obtener un reactivo
  de las mismas características practicamente por
  tiempo indefinido.
• La mayor ventaja de los mAbs sobre los Acs
  conencionales es la posibilidad de tener por
  tiempo indefinido un Ac de título estandarizado.
  Un gran número de mAbs han sido fabricado tanto
  para fines de diagnóstico como para fines de
  investigación.
• Su alta especificidad ha permitido la
  identificación de cepas similares como en el caso
  del Herpes simplex tipo I y II. Han sido usados
  también para el diagnóstico temprano de la
  producción de IgM en lesiones de pacientes.

26
Mecanismos celulares que se utilizan para terapia
con Mabs
27
Tratamiento de un linfoma a LB con un anticuerpo
Mab anti-idiotipo
28
Proyección de venta de anticuerpos monoclonales
para diagnóstico in vivo, in vitro y terapia
29
Problemas de la Inmunogenicidad

• Ingeniería genética para reducir la
  Inmunogenicidad
• Quimerización y humanización no son
  inmunogénicos?
• Anticuerpos humanos
• Phage Display
• Ratones transgénicos
• Ingeniería genética de anticuerpos para terapia
  de cáncer
• Estrategias experimentales
• Relación entre tamaño y función de Acs.
• Agentes citotóxicos y Anticuerpos
• Radionucleídos
• Quimioterapia
• Inmunotoxinas

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Evolución industrial de los Mabs y Acs.
Modificados para su uso en terapia Immunology
Today (2001)
31
Aplicaciones Clínicas de Anticuerpos

• Por qué aún son pocos los Acs. para la práctica
  Clínica?
• Reglamentación del uso de Anticuerpos
• Clara demostración de que la terapia es eficaz y
  segura, superior a los agentes convencionales
• Evidencias de que los efectos pueden ser
  controlados y la terapia puede ser suspendida
  cuando se desee sin efectos
• Su producción debe ser fácil y económica con
  respecto a la terapia convencional
• El costo efectivo de la terapia en relación al
  beneficio debe ser considerado
• debe eliminarse cualquier problema de
  inmunogenicidad si debe repetirse la terapia
• Evidencia de un corto tiempo de terapia puede
  brindar un largo tiempo de beneficio

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Ingeniería Genética de Anticuerpos para terapia

• Modificación de la región variable
• Optimizaciónde Acs. para su aplicación en terapia
• Ingeniería genética para la región constante.
  Identificación de sitios funcionales
• Introducción de dominios efectores en un
  fragmento de Ac.
• Vida media en el suero
• Nuevos anticuerpos y anticuerpos derivados para
  terapia humana
• Anticuerpos biespecíficos
• Expresión de anticuerpos y procesos de
  manufacturación

33
Aplicaciones Clínicas de anticuerpos

• Los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos son
  la terapia del futuro
• La afinidad de su interacción con el Ag y su
  larga vida media le permite competir con drogas
  sintéticas.
• Los Mabs han sido de gran importancia para
  definir la fisiopatología de numerosos procesos
  patológicos
• El uso de terapia de corto tiempo con Acs. para
  obtener un efecto modulatorio a largo plazo del
  sistema inmune es uno de los desafíos más
  exitantes del futuro de la terapia con Acs.
• En el área de terapia en cáncer se han obtenido
  en algunos casos resultados prometedores.

34
Variantes de los anticuerpos monoclonales
murino
humano
humanizado
Quimera
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Variantes de los anticuerpos monoclonales
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Variantes de los anticuerpos monoclonales
Inmunotoxina
37
Humanización de IgG
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Aplicaciones Clínicas de Anticuerpos

• Por qué aún son pocos los Acs. para la práctica
  Clínica?
• Reglamentación del uso de Anticuerpos
• Clara demostración de que la terapia es eficaz y
  segura, superior a los agentes convencionales
• Evidencias de que los efectos pueden ser
  controlados y la terapia puede ser suspendida
  cuando se desee sin efectos
• Su producción debe ser fácil y económica con
  respecto a la terapia convencional
• El costo efectivo de la terapia en relación al
  beneficio debe ser considerado
• Debe eliminarse cualquier problema de
  inmunogenicidad si debe repetirse la terapia
• Evidencia de un corto tiempo de terapia puede
  brindar un largo tiempo de beneficio

39
Lista selectiva de anticuerpos humanos,
quiméricos y humanizados en estudios clínicos
para cáncer
40
Fases de un producto descubrimiento hasta su uso
41
Porcentaje de homología de la región VH del Ac
humano y humanizado
42
Características de las Igs de camélidos
43
Comparación de fragmentos de Acs convencionales y
de camélidos
44
APLICACIONES DE LOS ANTICUERPOS EN
TERAPIACONCLUSIONES

• La mayoría de las aplicaciones terapéuticas de
  los mAbs fueron los obtenidos en ratón.
  Comenzaron a ser utilizados a partir de los años
  80'. Sin embargo existen un gran número de
  problemas en su utilización.
• A partir del desarrollo de la tecnología de los
  anticuerpos Mabs, desarrollada por Milstein y
  Köler en el año 1976, han surgido grandes
  expectativas en el uso de estas moléculas para el
  tratamiento del cáncer, ya que poseen
  características sumamente atrayentes para ser
  explotadas para éste y otros usos. Sin embargo,
  las expectativas creadas en torno a la
  utilización de los Mabs para el tratamiento de
  cáncer ha tenido grandes limitaciones.
• La inmunogenicidad de los Mabs murinos trató de
  reducirse mediante el uso de la ingeniería
  genética en la construcción de anticuerpos
  "quiméricos" y "huminizados".

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• La base de la tecnología para la producción de
  los Mabs, es que animales como roedores (rata,
  ratón) pueden ser inmunizados con un Ag y una
  población de LB específica para un epitope de
  dicho Ag puede ser seleccionada.
• La importancia del uso de esta tecnología es que
  puede obtenerse un Ac con una determinada
  afinidad para el Ag.
• La afinidad puede ser tan elevada como 1010 M-1
  con una mínima unión a epitopes relacionados.
  Algunas clases de Igs son capaces de reclutar
  linfocitos con el objeto de matar a la célula
  blanco a la cual están unidas, proceso que se
  conoce con el nombre de citotoxocidad anticuerpo
  dependiente (ADCC). El Ac unido a la célula
  blanco, también puede matar a la célula a través
  de la activación del Complemento, conocido con el
  nombre de citoxicidad complemento dependiente
  (CDC). Y estas son las propiedades que quisieron
  ser explotadas para matar la célula tumoral,
  mediante la producción de un Mabs específico para
  un Ag específico de dicha célula. Las Igs
  generalmente tienen una vida media lo
  suficientemente elevada como para poder cumplir
  con esta función (aproximadamente 20 días,
  dependiendo del isotipo).

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• Sin embargo la utilización de Mabs murinos para
  estos usos no ha tenidos el éxito esperado. i-
  Los isotipos murinos pueden reclutar muy
  débilmente linfocitos hacia la célula blanco,
  cuando de trata del sistema humano. ii-Los Acs de
  origen murino tienen una vida media mucho más
  corta que los humanos y iii- los Mabs murinos
  pueden desencadenar una fuerte repuesta inmune,
  que se conoce como HAMA (human activity
  monoclonal antibody). La HAMA puede producir
  severas reacciones de hipersensibilidad. La
  alternativa obvia es el uso de anticuerpos
  monoclonales humanos, que lógicamente no pueden
  ser obtenidos. Estos problemas aparentemente
  podían ser solucionados mediante la construcción
  de Acs quiméricos por ingeniería genética, que
  poseen la región variable del anticuerpo murino y
  la región constante humana. Estos anticuerpos
  quiméricos, que podrían ser capaces de
  desencadenar las mismas reacciones de
  citotoxicidad que los Acs humanos, sin embargo
  pueden también, a través de la región variable
  murina desencadenar una respuesta inmune.

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• Esta respuesta no deseada puede ser disminuida
  mediante la técnica de humanización de
  anticuerpos. Los pioneros fueron Winter y col.
  (año 1986).
• Se han ideado gran número de variantes con el
  objeto de incrementar la toxicidad del anticuerpo
  por la células target. Entre ellas podemos
  nombrar la producción de inmunoconjugados como la
  unión de toxinas, radionucleídos y enzimas.
  También se ha intentado la producción de
  anticuerpos bioespecíficos, que tienen un
  anticuerpo contra un marcador de la célula
  tumoral y un anticuerpo contra un marcador de la
  célula efectora.
• Un ejemplo acerca de la producción de
  anticuerpos humanizados es el 4D5, anticuerpo
  dirigido contra el receptor del factor de
  crecimiento de las células epidermales humanas,
  receptor que se encuentra aumentado en cáncer de
  ovario y mama.

48

• Se han publicado diversas estructuras surgidas
  de los estudios cristalográficos por difracción
  de rayos X de una serie de Acs y fragmentos Fab y
  Fv, algunos de ellos unidos con su antígeno.
  Estas estructuras muestran que la interacción
  Ag-Ac es similar a la asociación que ocurre en
  otras proteínas y que existe una extensa área de
  contacto. La superficie del Ag es de
  aproximadamente de 680-879Ä2 y de 690-886Ä2 en el
  Ac. Esta superficie involucra aproximadamente a
  14-21 residuos. Estos contactos forman entre
  10-23 puentes hidrógeno y 0-3 salinos. Estos
  contactos, generalmente involucran a los CDR y
  uno o dos framework. En general, para los
  complejos con lisozima, de la mayoría de los Acs
  contribuyen contactos con los seis CDR. También
  se ha observado que la unión con el Ag no produce
  cambios conformacionales importantes. Sin embargo
  pueden observarse ligeros desplazamientos de la
  región VH con respecto a la región VL. En otros
  casos, sin embargo se han observado grandes
  cambios del CDR3 de la cadena pesada, con el
  objeto de crear una especie de protuberancia para
  acomodar el péptido del antígeno.

49

• Humanización de Anticuerpos
• La estrategia se basa en transferir los
  segmentos del sitio de unión con el Ag de un
  anticuerpo monoclonal murino dentro de regiones
  framework humanas.
• El pionero de esta estrategia fue Winter en 1986,
  que demostró que la afinidad de un Ac
  anti-hapteno murino podía ser insertada dentro de
  un Ac humano. Esto era posible mediante la
  ingeniería genética, por tranferencia de los CDR
  murinos dentro de los framework humanos.
• Este experimento se realizó con los genes de un
  mieloma humano (proteína NEW, cuya estructura
  había sido determinada por cristalografía).

50

• Años más tarde, Riechman y col. usaron los
  framework de cadena H de la proteína NEW y los de
  la cadena liviana de la proteína REI
• Humanización el primer Ac con un potencial
  terapéutico, el anti-CAMPATH, Mab que estaba
  dirigido contra un marcador de linfocitos y
  monocitos.
• Contrariamente a lo esperado, el Ac obtenido
  presentaba una afinidad por el Ag mucho más baja
  que el Ac. original. Un minucioso examen de la
  estructura del anticuerpo humanizado reveló que
  había un defectuoso empaquetamiento entre los CDR
  murinos y los framework humanos, que fue
  corregido mediante un cambio de un aa.
• En contraste a estos éxitos iniciales, la
  humanización fue mucho más problemática de lo
  esperado, ya que residuos de los framework
  originales está involucrados en la unión con el
  Ag.