Bakterien PCR

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Bakterien PCR
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Überblick

• Epidemiologie
• 16s Bakterien PCR

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Bakterienquelle

• Spender Haut
• Inapparente Spender Bakteriämie
• Kontamination während der Spende
• Umgebung (Staub usw.)
• Equipment

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Frequenz von Bakterienkontamination bei
Blutprodukten

• American Red Cross
• Kultur positive Einheiten
• RBC 0 - 0,2
• SDP 0 10

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Transfusionsreaktionen

• Berichte an die FDA
• 77/694 1987-1999
• BaCon national study
• 34 Fälle davon 9 mortal 1998-2000
• Johns Hopkin study
• 23 Fälle davon 4 mortal 1987-1998

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BaCon study (US CDC)

• Nationale Studie
• AABB, ARC, DoD und CDC (60 US Blut)
• Stringente Sepsis-Definition
• Fieber, Tachykardie, 2 fache Blutkulturen
• Kuehnert et al, Transfusion 2001,411493-1499

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BaCon study I
RBC SDP RDP (6/tx)
Distributed 23.711.169 1.804725 1.033.671
cases (deaths) 5 (3) 18 (4) 11 (2)
cases/10E6 0,21 9,98 10,64
deaths/10E6 0,13 2,22 1,94
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BaCon study II
Product Contaminant Store Endotoxin
RBC S. liquefaciens 16d yes
RBC S. liquefaciens 35d yes
RBC S. epidermidis 22d no
RDP S. marcescens 2d yes
RDP S. marcescens 2d no
SDP E. cloacae 3d yes
SDP P. rettgeri 3d yes
SDP E. coli 2d no
SDP Gp B Strep. 4d no
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Risikovergleich
HIV
11000
110 000
HBV
Septic Fatalities (platelets)
1100 000
HCV
11 000 000
2000
1996
1994
1992
1990
1988
1986
1984
1998
Goodnough LT e t al. NEJM 1999
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Erregerspektrum

• Yersinia enterocolitica 50
• Pseudomonas putida 4
• Pseudomonas fluorescens 25
• Escherichia Coli
• Streptococcus sp 4
• Serratia marcescens 10
• Salmonella choleraesuis 13
• ......................................

• Bacillus cerus 6
• Clostridium sporogenes
• Enterococcus faecalis
• Lactobacillus fermentum
• Salmonella choleraesuis
• Pseudomonas aeruginosa
• Staphylococcus aureus 6
• Staphylococcus epidermidis 25

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Methoden

• Fluoreszenz Färbung /image analysis
• Immunologische Detektion (antigens)
• Detektion von 16s RNA
• Metabolische Änderungen
• Kultivierung

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PCR Target

• Homologe DNA Sequenzen bei Bakterien
• 16s RNA
• 23s RNA
• 16s-23s RNA interspace Region

  70S-Ribosomen Prokaryoten 70S-Ribosomen Prokaryoten
  50S-Untereinheit 30S-Untereinheit
Bestandteile 23S rRNA 5S rRNA 16S rRNA  
Bestandteile 33 Proteine (L1 L36) 21 Proteine S1 S21
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Strukturvergleich von 16s RNA
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16s DNA Alignment
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Realtime Technik

• System geschlossen
• Qualitative Ergebnisse
• Quantitative Ergebnisse
• Schnelle Ergebnisse
• Computergestützte
• Auswertung

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16s PCR-Screening

• Anforderungen
• Sensitivität
• Spezifität
• Automatisierung
• Ergebnisse in 8h

• Probleme
• Kontaminierte Enzyme
• Exogene Kontamination
• Spezifität (alle Bags)

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Extraktion von Bakterien

• MagNA Pure LC
• 32 Extraktionen in 1,5 Stunden
• Mgrade Chemie für Bakterien und Pilze

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PCR Amplifikation
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16s PCR BLZ Linz
E.Coli aus BacTAlert Flaschen
100cfu
10cfu
1cfu
NTC
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Sequenzierung

• Erregeridentifizierung
• Positive PCR-Reaktionen werden Sequenziert.
• Sequenz BLAST

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• ENDE