Biolog

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Biología Molecular en el IHI
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Estudios Moleculares

• Hemoglobinopatías
• Sicklemia
• ?-talasemia
• Hemopatías malignas

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ESTUDIOS MOLECULARES ENANEMIA
DREPANOCÍTICA(SICKLEMIA)

• Diagnóstico prenatal
• Detección de ?-talasemia
• Determinación de los haplotipos asociados al
  gen ?S

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Diagnóstico Prenatal de la Sicklemia

• PRIMERA APLICACIÓN CLÍNICA DE LA BIOLOGÍA
  MOLECULAR EN EL MUNDO Y EN CUBA.
• 1978- polimorfismo Hpa I.
• 1982- estudio directo de la mutación ?s.
• 1983- primer DP de la SS en el IHI.
• 1983- Primer lugar en el concurso Premio Anual
  de la Salud.
• Se realizaron los primeros 100 estudios.

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?- talasemia en SS

• Se determinó la frecuencia de ?-talasemia en
  pacientes SS (234 pacientes estudiados).
• frec (- ?) SS 0.1880
• frec (- ?) no-blancos AA 0.1136 p?
  0.001
• Encontramos que la ?-talasemia aumenta con la
  edad, es decir, que aumenta la sobrevida.
• (G.Martinez et al Age dependence of the gene
  frequency of ? - thalassemia in sickle cell
  anemia in Cuba. Blood 88 1898,1996).

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Haplotipos asociados al gen ?s

• Se determinó la frecuencia de los diferentes
  haplotipos asociados al gen ?s (91 pacientes
  estudiados).
• Benin 51 Bantú 41 Senegal 8
• Se encontró que la frecuencia del haplotipo Bantú
  disminuye y el Senegal aumenta con la edad del
  paciente SS.
• (A. Muñiz et al Sickle cell anemia and ?-
  gene cluster haplotypes in Cuba. Am J Hematol
  1995, 49 163).

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Bases Moleculares de la ?-talasemia

• Se establecieron las bases moleculares de la
  ?-talasemia en la población cubana.
• Se identificaron 17 mutaciones diferentes.
• Las mutaciones más frecuentes fueron
• Codón 39 (30.5) IVS1- 110 (8.5)
• -29 (13.4) IVS2- 1
  (8.5)
• La gran variabilidad de las bases moleculares
  hace muy difícil el diagnóstico prenatal de la
  talasemia mayor y de
• la S/ ?-talasemia.
• Los resultados moleculares conjuntos en SS y
  ?-talasemia constituyeron el tema de una Tesis de
  Doctorado.

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Estudios Moleculares en Hemopatías Malignas

• Reordenamiento de los genes de las Igs y RT en
  síndromes linfoproliferativos.
• Genes híbridos originados por translocaciones y
  otras alteraciones en leucemias.
• Quimerismo molecular en TMO

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Comienzan en 1985 con la técnica de Southern
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Resultados en esta primera etapa (1980-90)

• Los estudios del reordenamiento de los genes de
  las Igs y del RT que demostraron
• Heterogeneidad molecular en la LLC.
• Reordenamiento no productivo en LLC (mutación
  tipo talasemia).
• Estos resultados, unidos al estudio inmunológico
  y la evaluación clínica recibieron el Primer
  Lugar en el Premio anual de la Salud (1989).
• Se contribuyó al diagnóstico y estadificación de
  los linfomas.

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Resultados en esta primera etapa (cont.)

• Se realizaron aportes en la LMC apoyando los
  resultados de otros autores sobre la
  heterogeneidad molecular de esta entidad.
• Estos estudios en LMC dieron lugar a una Tesis de
  Doctorado.

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En 1996 se introduce la técnica de RT-PCR
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Alteraciones moleculares estudiadas en el IHI

• Alteración Gen híbrido
• t(1517) PML-RAR?
• t(1221) TEL-AML1
• t(821) AML1-ETO
• t(922) BCR-ABL
• t(411) MLL-AF4
• inv 16 CBF?-MYH11
• DIT FLT3

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Leucemia Mieloide Aguda

• Alteración No. de casos
  
• PML-RAR? 104 (97)
  93.0
• AML1-ETO 78 (15)
  20.0
• CBF?-MYH11 80 (4)
  5.0
• MLL-AF4 52 (1)
  2.0
• DIT FLT3 108 (17)
  17.0
• (DIT FLT3 () en LPA 53)

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LMA con Subtipo Dudoso
Diagnóstico Morfológico Diagnóstico
Molecular 2 pacientes M3 ó M4
1 M4 1 M3
t(1517) 4 pacientes M2 ó M3
1 M3 t(1517) 3 M2
t(821) 1 paciente M3 ó M7
1 M3 t(1517)
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Leucemia Promielocítica Aguda

• El estudio molecular comenzó en 1995.
• 104 pacientes estudiados
• 97 (93 ) pacientes RT-PCR
• 7 ( 7 ) pacientes RT-PCR
• (En un paciente se comprobó
  PLZF-RARA)
• Frecuencia de los puntos de ruptura (bcr)
• bcr 1 66
• bcr2 5
• bcr3 29

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Posible quimera M3M5 en LPA diferente respuesta
clonal al tto. con ATRA y quimioterapia
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Leucemia Linfoide Aguda

• Alteración No. casos
• TEL-AML1 164 (33) 21.0
• BCR-ABL 154 (3 M 7 m) 6.5
• MLL-AF4 154 (5) 3.2

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Leucemia Mieloide Crónica
t(922) bcr-abl
Puntos de ruptura No. Casos
p210 b3-a2 61 (35) 57.4
p210 b2-a2 61 (24) 39.3
p210 b2-a3 1 1.6 p190
e1-a2 1 1.6
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Quimerismo Molecular en TMO

• 12 TMO monitoreados
• 9 hemopatías malignas
• 3 hemopatías no malignas
• Resultados al mes
• QC 9
• No quimera 2
• QM 1 (que posteriormente pasó a QC).

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Resumen de los resultados de nuestro Dpto.

• Aproximadamente 100 publicaciones.
• 3 Premios del Concurso del Minsap
• 3 Tesis de Doctorado
• 15 TTR de residentes de Hematología
• 1 TTR de un residente de Genética Médica
• 8 Trabajos de Diploma de la Universidad
• Varios cursos nacionales e internacionales.

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Perspectivas Futuras
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Qué se está haciendo en el Mundo ahora?

• RT-PCR cuantitativo
• Estudio del Transcriptoma
• Estudio del Proteoma
• Terapia Molecular Dirigida

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RT-PCR cuantitativa

• Gran importancia en el seguimiento de la LMC.
• La importancia en LPA está aún por determinarse.
• En LLA, el resultado de la RT-PCR cuantitativa al
  final de la inducción y al finalizar la
  consolidación determina el riesgo
• alto intermedio bajo

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Progresión del Genoma al Proteoma
GEN
Genoma
Transcripción
Perfil de la expresión génica (Microarray
analysis)
Transcriptoma (variantes de empalme)
ARNm
Traducción
Proteína
Proteoma
Análisis del proteoma (Proteomics)
Modificaciones post-traduccionales

Interacción con otras proteínas
Funciones
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Transcriptoma

• Es el conjunto de ARNm expresados en una célula o
  tejido en un momento dado.
• Permite identificar subclases moleculares que no
  se pueden detectar por técnicas convencionales.
• Puede ayudar en el diagnóstico.
• Permitirá conocer el mecanismo de resistencia a
  las drogas.
• El objetivo futuro es caracterizar la célula
  madre para eliminar el clon neoplásico en su
  origen.

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Proteoma

• Representa la población de proteínas en una
  célula o tejido en un momento dado.
• Detecta la localización, las modificaciones
  post-traduccionales, interacciones y recambio de
  las proteínas.
• Es a nivel del proteoma que el gen ejerce su
  función.
• Ofrece una mejor comprensión del estado
  fisiológico y patológico de un organismo.

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Desventajas

• Transcriptoma
• No detecta modificaciones post-traduccionales ni
  las interacciones entre las proteínas.
• Existen diferencias entre la vida media de los
  ARNm y la vida media de las proteínas.
• Proteoma
• Las técnicas son complejas.
• No puede detectar proteínas en poca cantidad.
• No puede hacer un análisis en una sola célula.

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TERAPIA MOLECULAR DIRIGIDA

• Cada día se conocen nuevos mecanismos
  moleculares en la patogenia de las leucemias.
  Esto ha permitido que se desarrollen terapias
  moleculares dirigidas contra una mutación
  específica.
• Ejs. ATRA en LPA
• Glivec en LMC
• Inhibidores del FLT3
• El objetivo futuro es mejorar la terapia
  molecular y lograr que llegue a ser una terapia
  personalizada según el genotipo de cada paciente.