Microarray Data Analysis

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Microarray Data Analysis
Letizia Magnoni Junior Scientist Sienabiotech Spa
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Argomenti

• Cosa e un esperimento di microarray
• A cosa serve
• Come si puo disegnare un esperimento
• Normalizzazione
• Analisi
• Analisi Cluster
• Annotazioni dei geni selezionati

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Gene expression

• Ogni cellula contiene una copia completa del
  genoma dellorganismo.
• Esistono vari tipi e stati di cellule (cellule
  di sangue, nervi e pelle, cellule che si
  dividono, cellule cancerogene, ecc.)

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Variazione dellespressione

• Cosa rende le cellule diverse tra loro?
• Lespressione differente dei geni, cioe quando,
  dove e quanto ogni gene e espresso.
• In media, il 40 dei nostri geni e espresso in
  ogni momento.

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mRNA
cDNA
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Perche Microarrays

• In passato solo analisi di un gene (o pochi) alla
  volta (Northern blot)
• Oggi fino a 40.000 geni su una sola microarray.

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Applicazioni di Microarrays

• Individuazione di target per farmaci e
  validazione
• identificazione di geni modulati in modo
  specifico rispetto ad una certa malattia
  (differential expression)
• Elicidazione dei meccanismi dellazione
• Drug safety profiling
• Guilt by association (geni con comportamento
  connesso tra loro)
• Pathway modeling
• Classificazione di nuovi composti
• Diagnostica
• Identificazione di Biomarkers

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Disegno di un esperimento

• Insieme dei trattamenti selezionati per il
  confronto
• La specificazione delle unita a cui verranno
  somministrati i trattamenti
• Le regole secondo cui i trattamenti vengono
  assegnati ad ogni unita sperimentale
• La specificazione delle misurazioni (R/G)

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Disegno Sperimentale

• Fonti di variazione
• Variazione biologica
• Variazione tecnica
• Variazione dovuta alla collocazione degli
  elementi nelle arrays.

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Vari Disegni Sperimentali

• Dye-swap

B

• Dye-swap ripetuto

• Dye-swap con replica biologica

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Vari Disegni Sperimentali

• Reference

N.B. Questo disegno sperimentale non mette in
luce la variabilita introdotta dalla colorazione.
A mix B

• Per migliorare questo disegno

N.B. Meta delle misurazioni vengono fatte nel
campione di minore interesse.
A mix B
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Vari Disegni Sperimentali

• Loop

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Trattamenti
A
B
Replicati
A2
A1
B1
B2
RNA1
RNA2
RNA3
RNA4
Colorazioni
G
R
G
R
G
R
G
R
Arrays
A1
B1
Disegno
A2
B2
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Trattamenti
A
B
Replicati
A1
A2
B1
B2
RNA1
RNA2
RNA3
RNA4
Colorazioni
Arrays
Disegno
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Normalizzazione

• Si vuole togliere dai dati tutta quella
  variabilita che non ha origine biologica
• Campioni (isolamento, estrazione di RNA,..)
• Probe nature (cDNA clones, oligos, ..)
• Arrays (substrato, lotto, difetti di superficie,
  ..)
• Colorazione (colore, attivita specifica, ..)
• Ibridizzazione (tempo, temperatura)
• Misurazione (hardware, software, saturation)

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Normalizzazione

• Possibili approcci
• Housekeeping genes set (which genes, mean value)
• Complete gene set (min./selected/all,
  fluorescence intensity)
• Spiked exogeneous control mRNAs (mean value)
• Linear regression analysis

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Tecniche di normalizzazione

• Normalizzazione dellintensita totale
• Questo tipo di normalizzazione assume una uguale
  quantita di mRNA per entrambi i campioni
  etichettati.
• Si cerca una costante c che aggiusti i dati in
  modo tale che i due campioni abbiano media o
  mediana uguale.

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Normalizzazione dellintensita totale
La trasformazione degli assi coordinati ci
permette di visualizzare meglio i dati
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Tecniche di Normalizzazione

• Tecniche di Regressione
• Regressione lineare dei dati e successiva
  normalizzazione in modo tale che il coefficiente
  lineare della retta di regressione abbia
  coefficiente angolare unitario.
• Regressione lineare locale (LOWESS)LOcally
  WEighted Scatter plot Smooth

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Normalizzazione con tecniche di regressione locale
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Analisi Statistica dei dati

• Si vuole rispondere alle domande
• La differenza che vedo nei miei dati e
  significativa?
• Le differenze osservate sono dovute solo alla
  diversa risposta dei campioni ai trattamenti?

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T-test con due campioni confronto tra le due
medie

• Ipotesi
• I campioni hanno distribuzioni normali
• I campioni sono originati da due variabili
  indipendenti
• Due possibili assunzioni sulle varianze se o
  altrimenti.

La statistica test ha una distribuzione t di
Student
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Confronto tra medie di due campioni in un
esperimento di Microarray

• Si vogliono evitare tutte le assunzioni fatte
  precedentemente.
• Statistica test (Welch Statistic) per ogni gene
  i calcoliamo

• Per determinarne la distribuzione possiamo
  utilizzare algoritmi di permutazione o di
  bootstrap.

B. Efron, R. J. Tibshirani An Introduction to
the Bootstrap, Chapman Hall (1993) S. Dudoit
et al Statistical methods for identifying
differentially expressed genes in replicated cDNA
Microarray Experiments, Statistica Sinica
12(2002), pp 111-139
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Permutation test

• Stima la distribuzione della statistica test
  sotto lipotesi nulla (che non ci sia differenza
  tra i due campioni) tramite permutazioni dei
  campioni etichettati.
• Il p_value e dato come frazione delle
  permutazioni per cui il valore della statistica
  test e (almeno) tanto estremo quanto quello che
  e stato osservato.

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Multiple testing

• Supponiamo di avere un esperimento con 10.000
  geni e decidiamo di controllare lerrore di tipo
  I al 5 (rifiuto lipotesi nulla quando il
  p-value e minore di 0.05)
• il valore atteso di rigettare in modo errato
  lipotesi nulla sara 10.000 x 0.05 500.

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Multiple testing methods

• Dobbiamo considerare il fatto di dovere
  aggiustare il livello di significativita del
  nostro test (multiple testing procedure)
• Bonferroni (non e consigliabile per esperimenti
  di microarrays)
• Westfall and Young step-down procedure
• False Discovery Rates (FDR Benjamini and
  Hochberg, 1995)
• Dudoit et al, Multiple Hypothesis Testing in
  Microarray Experiments, U.C. Berkeley Division
  of Biostatistics Working Paper Series, 2002

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Modelli ANOVA

• Questi modelli cercano di dare una stima delle
  piu importanti fonti di variabilita presenti in
  un esperimento.
• Arrays (Ai) i 1,2,..,arrays
• Dyes (colorazione) (Dj) j 1,2
• Varieties (trattamenti) (Vk) k
  1,2,..,varieties
• Genes (Gg) g 1,2,..,genes

Il modello che si assume e
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Modelli ANOVA e disegno sperimentale

• Disegno Dye-Swap
• Disegno reference

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Analisi da un punto di vista Bayesiano

• Entrambe le tecniche presentate hanno un
  approccio mediante la statistica Bayesiana.
• P. Baldi,A Bayesian framework for the analysis
  of microarray expression data regularized t-test
  and statistical inferences of gene changes,
  Bioinformatics, Vol.17, no 6, pp 509-519 (2001)
• D.A.Henderson, Bayesian Statistical Methods for
  the Detection of Differential Gene Expression and
  Control of Multiple Hypothesis Testing in cDNA
  and Oligonucleotide Microarray Experiments,
  University of Arizona

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Siti interessanti

• http//www.stat.berkeley.edu/users/terry/Group/ind
  ex.html
• http//www.jax.org/staff/churchill/labsite/researc
  h/index.html
• http//www.gene-chips.com/
• http//www.nslij-genetics.org/microarray/analy.htm
  l
• http//www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html
• http//www.bioconductor.org/
• http//www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/
  chip.html

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Grazie