In vitro DNA AMPLIFIKASYONU PCR

1
In vitro DNA AMPLIFIKASYONUPCR
Elektroforezis

• Doç.Dr.Öztürk ÖZDEMIR

2

• In vitro DNA Amplifikasyonu
• 1- Moleküler klonlama, DNA parçalarinin, bakteri
  gibi basit yapili organizmalarda çogaltilmasidir.
• Bu yöntemde çogaltilacak hedef DNA,
• vektör adi verilen ekstra kromozomal DNA
  molekülüne (plazmid) transfer edilir.
• Olusan rekombinant plazmid ise uygun bir bakteri
  hücresine sokularak bakterinin çogaltilmasiyla in
  vivo olarak amplifiye edilmis olur

3
POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR
2. DNAnin çogaltilabilecegi bir teknik, 1983 de
Kary Mullis adli bir biyokimyacinin gelistirdigi
Polimeraz Zincir Reaksiyonudur. Ilk kez
basarili in virto DNA amplifikasyonu Saiki ve
ark. Tarafindan 1985 yilinda gerçeklestirildi.
4

• Amplifikasyon yöntemlerinin gelismesinde iki
  önemli nokta
• termofilik Thermus aquaticus tan isiya stabil
  DNA polimeraz
• bilgisayar kontrollü termal döngü cihazlarinin
  gelistirilmesi

5

• PCRnun Kullanildigi Alanlar
• PCRnin gelistirilmesi, moleküler
  biyoteknolojinin ve kullanim alaninin da
  genislemesine yol açmistir
• Moleküler biyoloji ve biomedikal arastirmalar
• Bakteriyel, viral, fungal ve protozoal hastalik
  etkenlerinin teshisi
• Gida, su ve yiyeceklerde bulunan
  mikroorganizmalarin tanisi
• Genetik bozukluklar ve kanser taramalari

6

• Prenetal tani ve cinsiyet belirlenmesi
• Gen tedavisi ve DNA asilari
• Adli tipda suçlu teshisi
• Antropoloji

7
PCRnun Çalisma Prensibi PCR küçük
volumlar halinde hazirlanir (0.5 mllik mikrofüj
tüpüne, 100 ml hacminde materyal konur)
8
PCR için gerekli malzemeler 1- Hedef diziyi
tasiyan kalip DNA (az miktarda ve ilgisiz
DNAlarla kontaminasyon sorun degildir) 2- Kalip
DNA çift iplikleri ile eslesebilen 2 tür
oligonükleotid primeri (15-30 bazlik ve tek
iplikli) 3- Dört tür dNTP (dATP,dCTP,dGTP,dTT
P) 4- Termostabil DNA polimeraz enzimi (Taq,
Vent)
9
Bu materyaller bir tampon çözeltisi içinde
karistirilir. MgCl2 gereklidir. Thermal
Cycler adi verilen özel bir cihaz kullanilarak
DNAnin amplifikasyonu gerçeklestirilir. Bu
cihaz, PCR örnegini programlanan isi
derecelerinde ve istenilen sürelerde tutmaya
yarar.
10
Her bir PCR döngüsü üç asamada
gerçeklestirilir. 1- Hedef DNAnin
denatürasyonu (95 oC de 5 dak.) ds DNA nin
birkaç saniyede isi ile ss DNA ya ayrilmasidir.
(döngüye baslamadan 3-5 dk ön isitma
yapilabilir) 2- Primerlerin baglanmasi (42-52 oC
de 5 dak.) örnek 1-2dk bu isida tutularak
primerlerin (spesifik sentetik
oligonükleotitler) ss DNA daki hedef bölgelere
hibridizasyonu saglanir. 3- Polimerizasyon
(65-72 oC de 5 dak.) polimeraz enzimi
yardimi ile ss DNA kaliplarina baglanan
primerlerin 5 3 yönde uzatilmasidir. Her
döngüde elde edilen yeni DNAlar bir sonraki için
kalip görevi gördüklerinden, 25-30 döngü sonunda,
DNAnin milyonlarca kopyasi elde edilir.
11

• Taq DNA polimeraz optimal uzama sirasinda yani
  72-78 C arasinda 2000 nükleotid/dakika hizinda
  çalisir.

12
Polymerase Chain Reaction

• In vitro DNA (gene) amplifikasyon teknigi

gt90
13
Polymerase Chain Reaction
4060
14
Polymerase Chain Reaction
72
15
Polymerase Chain Reaction
16
Polymerase Chain Reaction
17
Polymerase Chain Reaction
18
Polymerase Chain Reaction
19
PCR 3 steps
20
(No Transcript)
21
(No Transcript)
22
PCRnun Avantajlari Çabuk Duyarli Yüksek
özgüllüge sahip
23
PCRnun Dezavantajlari
Pahali Kros
reaksiyonlar/non-spesifik DNA
amplifikasyonu ? Sterilite
Yalanci pozitif/negatif degerlendirme ?
Deneyimli personel
24
Her teknikte oldugu gibi PCRda da optimizasyon
sarttir. Yüksek özgüllügü ve duyarliligina
ragmen düsük ürün miktari primerlerden
kaynaklanabilen non-spesifik ürün eldesi
kontaminasyon sonucu yalanci pozitif
sonuçlar gibi sorunlar yasanabilmektedir. Iyi
bir teknik kadro ve pozitif/negatif kontroller
kullanilarak bu sorunlar giderildigi taktirde
PCR, biyoteknologlarin hayatini kolaylastiran bir
tekniktir.
25
(No Transcript)
26
(No Transcript)
27
(No Transcript)
28
(No Transcript)
29

• PCR ile Saptanan Bakteriyel Patojenler
• Bacillus antracis
• Corynebacterium diphtheriae
• Shigella sp
• Vibrio cholerae
• Mycobacterium avium
• Mycobacterium tuberculosis

30

• PCR ile Saptanan Viral Patojenler
• Hepititis A,B,C,E,G
• Insan papillomavirus
• HIV-I,II
• Influenza virus
• Rubella virus
• Herpes simplex virus

31

• PCR ile Saptanan Fungal Patojenler
• Blastomyces dermatitis
• Histoplasma capsulatum
• Candida albicans
• Pneumocyctis carinii

32

• PCR ile Saptanan Protozoal Patojenler
• Plasmodium falciparum
• Leishmania sp
• Toxoplasma gondii
• Trypanosoma sp.

33
Amplifikasyon Ürünlerinin Tespit Edilmesi

• PCR ile amplifiye edilen DNAyi tespit etmenin
  bir yolu
• Elektroforez

34
Elektroforez prensibi

• powder
• ion

35

• DNA proteinler ve birçok biyomoleküller gibi
  elektriksel yük tasir.
• DNA negatif yüklüdür.Bu nedenle anoda dogru
  hareket eder.Yükleme katod tarafina yapilmalidir.
  
• DNA molekülleri sekilsel ve elektrik yükü
  bakimindan benzer oldugundan elektroforez
  kriterlerine göre ayrilmaz
• DNA molekülleri büyüklüklerine göre ancak bir jel
  içinde ayrilabilirler.

36

• DNA molekülleri genellikle agaroz ya da
  poliakrilamid jel içinde elektroforez edilir.
• Jellerin içerisinde DNA moleküllerinin girip
  hareket edebilecekleri porlar vardir.
• Elektroforez ile ayrilan DNA yi görmek için ise
  etidyum bromid ile boyanir.(UV boya)

37
(No Transcript)
38
PCR - analiziJel-elektroforez
39
(No Transcript)
40
PCR Viral detection
41
Tüm Asamalari Özetleyecek Olursak
42
Thermal Cycler
Elektroforez
3-4 hours
Ürinlerin degerlendirilmesi (Agaroz jel)
UV translüminatör