DIAGNOSTIC D'UNE INFECTION BACTERIENNE

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DIAGNOSTIC D'UNE INFECTION BACTERIENNE
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Généralités

• DIAGNOSTIC DIRECT mise en évidence de la
  bactérie elle-même, donc finalement de sa culture
  ou isolement qui permettra l'identification
  ultérieure ainsi que de préciser sa sensibilité
  aux antibiotiques (antibiogramme).
• DIAGNOSTIC INDIRECT mis en évidence de la
  réponse de l'organisme à l'infection par la
  présence d'anticorps spécifiques, le plus souvent
  sériques ou plus rarement par une réponse
  dhypersensibilité, dite allergique.

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Examen direct Demande

• Important Identification du patient par son nom,
  son prénom, sa date de naissance...
• Il existe une procédure standard de recherche de
  cellules et de germes, d'où l'appellation
  suivante "Examen cytobactériologique des urines
  ou ECBU".
• Le clinicien ne devra jamais oublier d'indiquer
  toute demande ou recherche particulière, en
  raison de l'utilisation de milieux spéciaux.

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Examen direct Examen macroscopique

• Toute infection bactérienne s'accompagne, outre
  la présence de bactéries, de signes biologiques
  liés à l'inflammation avec l'éventuelle présence
  de leucocytes.
• Ces éléments peuvent entrainer au delà d'un
  seuil, une modification visuelle, clairement
  perceptible à l'oeil nu, qui signe une anomalie
  patente. Divers éléments sont alors obtenus comme
  le montrent les exemples suivants
• Trouble, hématurique, coloration anormale, odeur
  et consistance.

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Examen direct Examen microscopique, état frais

• Etat frais
• une préparation est obtenue avec le dépôt d'une
  goutte entre lame et lamelle, puis on observe au
  microscope
• Présence éventuelle de bactéries (coque,
  diplocoque, chainette, coccobacille, bacille...),
  
• le type de mobilité.
• Evaluation des cellules avec une appréciation
  semi-quantitative (rares, peu nombreux, nombreux,
  très nombreux...) ou mieux quantitative, exprimée
  par nombre d'éléments / mm3 ou ml.

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Examen direct Examen microscopique, après
coloration

• Coloration de Gram permet de distinguer les
  bactéries colorées en violet (G) de celles en
  rose (G-).

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Examen direct premières conclusions

• Les éléments récoltés de l'examen macroscopique
  et surtout microscopique fournissent souvent des
  arguments diagnostiques de très forte
  présomption.
• La culture ou l'isolement de l'agent causal sera,
  cependant, essentielle. Elle permettra
  l'identification ultérieure mais aussi de
  préciser sa sensibilité aux antibiotiques
  (Antibiogramme).
• Le diagnostic indirect sera quelquefois le seul
  recours diagnostique possible dans quelques
  maladies comme la syphilis.

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Culture - Isolement

• Divers milieux sont utilisés qui doivent
  satisfaire les besoins nutritifs et énergétiques
  des bactéries à cultiver.
• En pratique, sont utilisés plusieurs milieux
  solides (gélosés) avec une technique particulière
  d'ensemencement (isolement orthogonal ou en
  cadran) permettant l'isolement de clones
  bactériens sous la forme de colonies (de l'ordre
  de 106 bactéries).

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Culture Exemples de milieux solides coulés en
boîte de pétri selon le produit pathologique et
la demande

• Pus, liquides de ponction milieux enrichis au
  sang, milieu sélectif (Chapman, ou sur demande
  Loewenstein-Jensen)
• Expectoration milieux enrichis au sang (frais,
  cuit), milieu sélectif (Chapman Drigalski ou sur
  demande Lowenstein-Jensen)
• Urines milieu sélectif (Drigalski), milieu
  polyvalent pour bactéries G et G- .
• Selles (coproculture) milieux sélectifs
  (Drigalski et SS pour entérobactéries telles
  Salmonella et Shigella,

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Culture Exemples de milieux liquides

• L'usage de milieux liquides est limité en raison
  de l'absence possible d'isolement.
• Sang, pus, liquides de ponction milieux
  enrichis (flacons pour hémoculture,.....
• Selles (coproculture) milieu sélectif
  (Muller-Kauffman).

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Culture Incubation

• Après ensemencement, mise en incubation dans une
  étuve ou une chambre chaude à 37C
• en atmosphère ambiante (culture aérobie),
• en l'absence d'oxygène (culture anaérobie.

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Culture délai dincubation

• De très nombreuses espèces bactériennes cultivent
  après 18 à 24 H d'incubation à 37C.
• D'autres espèces ont des délais d'incubation plus
  longs telles Mycobacterium tuberculosis (temps
  moyen d'isolement de l'ordre de 21 jours)
• Les cultures sont examinées en notant la quantité
  de colonies obtenues de manière
• Semi-quantitative (rares, peu nombreuses,
  nombreuses, très nombreuses) pour les liquides de
  ponction.
• Quantitative (104, 105, 106 ..../ml) pour les
  prélèvements urinaires et pulmonaires.
• Autres éléments pris en compte sont
• Culture en aérobiose et/ou en anérobiose.
• Aspect des colonies la taille, la bordure et la
  coloration Présence d'une hémolyse (alpha, béta).

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Culture exemple disolement
Pus sur une gélose au sang frais
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Culture Identification - Antibiogramme

• L'identification et l'antibiogramme de la
  majorité des bactéries habituelles est alors
  précisé dans un délai de 18-24 h.
• A l'aide de tests d'orientation rapide oxydase,
  catalase, coagulase...
• Par ensemencement d'une galerie biochimique
  adaptée
• Identification de Escherichia coli et Proteus
  mirabilis par un ensemble de réactions du
  métabolisme intermédiaire.

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Quelquefois cette procédure est insuffisante pour
l'identification d'une bactérie

• Il convient de faire appel
• soit à des modalités classiques de recherche
  d'autres caractères bactériens tels la croissance
  sur certains milieux pour l'identification des
  sources de carbone permettant la croissance, le
  type respiratoire, le type fermentaire, le type
  antigénique
• soit à des modalités modernes telles
  l'amplification génique de certains gènes ou
  encore le séquencage d'autres (ARNr 16S).

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Les autres moyens diagnostiques

• Produits bactériens

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Recherche d'antigène soluble

• Exemple d'une pneumopathie à Legionella
  pneumophila.
• Le test immunochromatographique aide au
  diagnostic présomptif des infections à Legionella
  en parallèle avec la culture ou d'autres tests. 
• Les avantages de ce test sont précocité (dès
  le début des signes), simplicité (sur urine),
  rapidité (en 30 minutes), diagnostic tardif (gt 2
  mois après les signes cliniques), même après un
  traitement antibiotique adapté, Donc bonne valeur
  prédictive mais ce test ne détecte pas les autres
  sérogroupes de L. pneumophila

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Méthode moléculaire

• Le principe en est simple puisqu'il consiste à
  amplifier un gène entier ou non avec des amorces
  spécifiques ou encore séquencé et comparé avec
  ceux déposés dans des banques.
• L'intérêt de ces diverses méthodes se résume
• Gain de sensibilité (X 2 par rapport aux méthodes
  classiques) pour la recherche notamment des
  Chlamydia génitaux.
• Simplicité et la rapidité d'exécution.

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Biologie moléculaire PCR "Polymerase chain
reaction" ou l'amplification génique

• La PCR est la technique la plus utilisée pour la
  détection (amplification) de lADN et de lARN.
• A partir dune simple copie dune séquence
  particulière dacides nucléiques, cette séquence
  peut être spécifiquement amplifiée et détectée.
• Couramment utilisée pour le diagnostic à partir
  du produit pathologique de germes de culture
  difficile, voire impossible, tel Chlamydia
  trachomatis.

Un appareil de PCR et la révêlation UV d'un
produit amplifié après électrophorèse sur gel.
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EXTRACTION DE LADN BACTERIEN
1. Lyse des bactéries 2. Fixation de l ADN
sur des billes de silice 3. Lavages 4.
Elution de l ADN par de l eau ou du tampon
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EXTRACTION DE L ADN BACTERIEN
EXTRACTION AUTOMATISEE SUR MAGNAPURE
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DETECTION DE LADN AVEC DES SONDES DHYDROLYSE
TAQMAN
R reporter et Q quencher Dénaturation de
lADN à 95 C La sonde se fixe vers 68-72 C Les
amorces se fixent vers 60 C La Taq ajoute des
nucléotides et détruit la sonde. Le reporter
se retrouve dans le milieu et émet une
fluorescence qui est détectée.
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AMPLIFICATION PAR PCR
Marqueur
Témoin positif
Marqueur de poids moléculaire
Témoin négatif
Echantillons
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Biologie moléculaire Séquençage

• ADN Séquence de 4 nucléotides
• Purines Adénine (A), Guanine (G)
• Pyrimidines Cytosine (C ), Thymine (T)

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Matériel génétique
Chromosome
Noyau
Cellule
ADN
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Un chromosome est comme une pelote de laine dont
le fil est lADN
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Un chromosome est comme une pelote de laine dont
le fil est lADN
28
LADN est une chaîne composée de 4  molécules
différentes symbolisées par les lettres A T G C
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C
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une séquence dADN
tgctgccatctacatttttgggactcgggaattatgtgagtaccgaaact
actta gcttatggtaggtgtaccacacgcacagggaaagaattgcgttt
atgtgggacag tgaaaacaatcgcaaaaaagcaatggaaagggctttga
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gctttgtgtggactgtcgaatttcaaagatttaccgtatgaccaaga gc
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cgg taaggaggtagaggtggaggcggagccggatgtcagaggtcctgaa
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tgtaggtgaccaatgtgactagctgtc ctgtgggggaaatatctcccca
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tgctctctccctggagaccggtgttttcttctcttgttggaggtt tcag
agactggggctccacaattgtcctgtcaatcctgaaggaggtcagatcct
g gccaggaaatctctgagtcctccaggaagtcctgagaagcagtggcca
c
Chez lhomme, Linformation génétique est formée
par un texte de 3 milliards de caractères unique
pour chaque individu  le génome humain
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Un gène
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mRNA virtuel
Traduction en protéine
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Séquençage de lADN

• Définition
• Technique permettant de déterminer la séquence
  (ordre des nucléotides) dune molécule dADN.

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Séquençage selon Sanger

• Polymérisation de lADN
• 5ATGGCTATGCCGAGACCATATTACGACCAG 3
• 3TACCGATACGGCTCTGGTATAATGCTGGTC 5

Nucléotides (dNTP)
A G T C C G A C G
Amorce
Matrice
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Didésoxyribo-nucléotides
Désoxyribo-nt
Didésoxyribo-nt
5
1
4
3
2
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Séquençage selon Sanger

• Réaction de séquençage (ddGTP)
• 5ATGGCTATGCCGAG
• 3TACCGATACGGCTCTGGTATAATGCTGGTC 5

dNTP ddGTP
Amorce
A G T C G C A C G
Matrice
37
Séquençage selon Sanger

• Réaction de séquençage (ddGTP)

5ATGGCTATG 3TACCGATACGGCTCTGGTATA 5
5ATGGCTATGCCG 3TACCGATACGGCTCTGGTATA 5
5ATGGCTATGCCGAG 3TACCGATACGGCTCTGGTATA 5
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Séquençage selon Sanger

• Séparation des produits

Electrode -
5ATGGCTATGCCGAG
5ATGGCTATG
5ATGGCTATGCCG
Gel dAgarose
Electrophorèse
Migration
Electrode
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Séquençage selon Sanger
ddA ddG ddC ddT
Electrode -
Gel dAgarose
Migration
Electrode
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Séquençage automatique
Ordinateur
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Séquençagenucléotide méthode de Sanger

• Liaison de lamorce avec lADN à séquencer.
• La fixation des ddNTP (désoxyNucléotide
  TriPhosphate) aux brins dADN va créer des brins
  de différentes tailles.
• Les brins vont migrer sur un gel délectrophorèse
  selon leur taille le plus petit migre le plus
  vite.

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Séquençagenucléotide méthode de Sanger
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Séquençagenucléotide méthode de Sanger

• Automatisation de la méthode
• Ajout sur les ddNTP de fluorochrome de
  différentes couleurs.
• 1 seul tube regroupant les ddNTP.
• Lecture par un laser des fragments qui migrent
  sur le gel.
• Stockage des données dans la mémoire de
  lordinateur.

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Séquençagenucléotide méthode de Sanger
45
Séquençagenucléotide méthode de Sanger
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Diagnostic indirect ou sérologique

• Le principe se base sur les conséquences induites
  chez l'hôte à savoir la production d'anticorps.
• La réaction immunitaire ne se développe qu'à
  partir d'un délai, de l'ordre de 8 à 10 jours.
• Techniques Les anticorps sont recherchés, le
  plus souvent, dans le sang circulant après prise
  de sang, de l'ordre de 5 à 10 ml sur tube sec
  sans anti-coagulant.
• Il existe diverses techniques pour déceler la
  présence d'anticorps
• Réaction d'agglutination.
• Recherche d'anticorps par ELISA.
• Recherche d'anticorps par immunofluorescence.
• Recherche d'anticorps par une technique de
  révêlation utilisant les globules rouges

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Une protéine comment cest fabriqué ?
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Noyau de la cellule Bibliothèque
Une cellule
Chromosomes (ADN) Livres de recettes (23 x 2
chez lhomme)
49
Noyau Bibliothèque
Une cellule
Chromosomes (ADN) Livres de recettes
1 recette pour 1 protéine 1 gène
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Noyau Bibliothèque Chromosomes (ADN) Livres
Une cellule
1 gène 1 recette
Photocopie de la recette (ARN)
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Noyau Chromosomes (ADN)
Une cellule
1 gène 1 recette
Photocopie de la recette (ARN)
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Noyau Chromosomes (ADN)
Une cellule
1 gène
Photocopie (ARN)
Machine à fabriquer les protéines (ribosomes)
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Une cellule
Photocopie (ARN)
Machine à fabriquer les protéines
54
Une cellule
Photocopie de la recette
Machine à fabriquer les protéines
55
Transcription et traduction