Il Controllo Ufficiale del Seme Andrea Galli

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Il Controllo Ufficiale del SemeAndrea Galli

• Istituto Sperimentale Italiano Lazzaro
  Spallanzani - Milano

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Controllo Ufficiale del Seme

• Aspetti biologici
• Seminologia
• Genetica Molecolare
• Aspetti normativi
• Legge 30/91
• DM 403/00
• DM 27.12.94

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Spermatozoo e acrosoma
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Parametri seminali

• Qualita estrinseca
• Concentrazione (Burker, Coulter-Counter)
• Motilita (CASA)
• Morfologia (CASA,PH, DIC)
• Stato di membrana
• Swelling Test (HOS)
• Integrita di membrana plasmatica (FCM)
• Reazione acrosomale (FCM)
• Capacita fecondante (FIV, ZP)
• Qualita intrinseca
• Stato della cromatina (FCM)
• Tracciabilita genetica

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Un test seminale deve essere

• Oggettivo
• Preciso
• Basso CV intra ed inter campionario
• Sensibile
• Basso intervallo di confidenza al 95 fra
  replicazioni
• Routinizzabile
• Economico

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CONCENTRAZIONECamera di Burker

• Conteggio delle singole cellule allinterno
  dei reticoli della cellula contaglobuli.

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CONCENTRAZIONECoulter-Counter

• Variazione dellimpedenza elettrica al passare
  degli spermi fra due elettrodi posti fra un
  capillare con soluzione isosmotica

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MOTILITACamera di Makler
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MOTILITASistema CASA

• Analisi automatica dimmagini applicata alla
  valutazione della cinetica degli spermatozoi

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MOTILITA Sistema CASA
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MOTILITA Sistema CASA

• E necessario settare adeguatamente lo
  strumento soprattutto in termini di numero di
  frames da acquisire ed analizzare ed in termini
  di valori soglia di velocita e linearita per la
  definizione della motilita progressiva.

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MOTILITA Sistema CASA

• I principali errori analitici sono dovuti a
• eccessiva concentrazione degli spermatozoi
• temperatura del campione inadeguata
• Settaggio inadeguato

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MOTILITASistema CASA

• Definizione delle tracce degli spermatozoi
  tramite definizione delloggetto spermatozoo in
  successivi frames

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MOTILITASistema CASA

• Report analitico per i principali parametri
• Concentrazione (non usato)
• Motilita
• Totale
• Progressiva
• Locale

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MORFOLOGIASistema CASA

• Valutazione morfometrica della testa dello
  spermatozoo e valutazione dello stato
  dellacrosoma

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Morfologia (DIC)

• Fissazione in glutaraldeide e visualizzazione in
  microscopia con contrasto interferenziale a 1250
  ingrandimenti.

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HOS

• Viene valutata la funzionalita di membrana
  incubando gli spermatozoi in una soluzione
  iposmotica.
• Membrana integra code piu o meno rigonfie
• Membrana alterata code normali
• Soggettivita del giudizio in situazione
  borderline.

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Citofluorimetria a flusso
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Integrita di membranaCarbossifluorescina-Ioduro
di propidio
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FCM Integrita di membrana

• Spermi Integri 77

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Qualita del seme e fertilita
Parametro Correlazione
Motilita totale 0.2/0.5
Motilita progressiva 0.1/0.7
Colorazione vitale 0.2/0.6
Swim-up ( Sp Risaliti) 0.3/0.5
Spermi filtratri 0.2/0.5
Acrosomi integri 0.2/0.7
Tempo Ind. Reaz. Acros. -0.4/-0.8
Inseminazione eterosp. 0.6/0.9
Inseminazione omosp. gt 0.0
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Qualita del seme e fertilita

• La notevole variabilita dei coefficienti di
  correlazione fra la qualita seminale e la
  fertilita e dovuta alla difficolta di una
  corretta stima della fertilita.

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Qualita del seme e fertilita
r0.75 Plt0.001
CASASCSAMI
Utilizzo di indici complessi
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Qualita del seme e fertilita

• Esiste una associazione asintotica fra fertilita
  e numero di spermi vitali (al momento della
  inseminazione)
• sopra un valore soglia (che cambia a seconda del
  livello di fertilita del riproduttore) la
  fertilita non aumenta.

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Marcatori Genetici Microsatelliti

Sequenze non codificanti di DNA consistenti di un
numero variabile di sequenze ripetute ognuna
caratterizzata da un dato numero di basi
identiche ripetute
2 pb lt
lt 5 pb MICROSATELLITE
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Microsatelliti
dinucleotide ripetuto
Differenti numeri di ripetizioni producono
frammenti di differente lunghezza
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Estrazione del DNA
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Amplificazione del DNA (PCR)
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Separazione dei frammenti tramite Elettroforesi
Immagine del Gel
standard ROX
FAM
HEX
TET
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Controllo Ufficiale del SemeDDMM 403/00 e
27.12.94

• Verifica corretta autocertificazione (VCA)
• Verifica corretta identificazione (VCI)

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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Qualita del seme e Centri Tori

• Per un centro di produzione seme e importante
  sviluppare modelli e/o approcci che consentano
  di massimizzare la produzione di dosi di seme
  congelato.

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Qualita del seme e fertilita

• Pur non esistendo modelli predittivi adeguati
  per stimare il livello di fertilita dalla
  qualita seminale, esistono approcci altrettanto
  utili per massimizzare la produzione di seme
  congelato presso un Centro Tori
• IL CONTROLLO STATISTICO DI QUALITA

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Carta di Controllo

• E possibile evidenziare se la misura della
  qualita di un lotto di seme congelato,
  determinata come Numero di Spermi
  Progressivamente Mobili, e allinterno o
  allesterno dei limiti (inferiore e superiore)
  della variabilita casuale (quella sempre
  presente in tutti i processi produttivi).
• Se uno o piu punti cadono allesterno di
  tali limiti andranno adottati opportuni
  provvedimenti.