SPEKTROSKOPIA NMR PODEJSCIE PRAKTYCZNE

1
SPEKTROSKOPIA NMRPODEJSCIE PRAKTYCZNE
mgr inz. TOMASZ LASKOWSKI
CZESC IV
2
CZESC CZWARTAVARIETAS DELECTAT
3
PROLOGOSODSPRZEGANIE SPINÓW(DECOUPLING)
4
ODSPRZEGANIE SPINÓW

• Eliminacja zjawiska sprzezenia spinowo-spinowego
  wystepujacego pomiedzy wybranym protonem a jego
  sasiadami poprzez selektywne naswietlanie tego
  protonu.
• Naswietlanie napromieniowywanie próbki fala
  elektromagnetyczna o czestotliwosci rezonansowej
  wybranego protonu przed rejestracja widma.
• W efekcie
• sygnal rezonansowy protonu naswietlonego nie
  pojawia sie w widmie
• w multipletowosci dotychczasowych partnerów
  sprzezenia naswietlonego protonu nie jest zawarta
  informacja o sprzezeniu z naswietlonym protonem.

5
ODSPRZEGANIE SPINÓW
A
C
A
D
B
D
C
B
B
D
C
6
ODSPRZEGANIE SPINÓW
A
C
A
D
B
D
C
B
A
C
D
7
ODSPRZEGANIE SPINÓW
A
C
A
D
B
D
C
B
A
D
B
8
ODSPRZEGANIE SPINÓW
A
C
A
D
B
D
C
B
A
C
B
9
ODSPRZEGANIE SPINÓW

• ZALETY
• Decoupling zwalnia z obowiazku okreslania
  multipletowosci wszystkich sygnalów
  rezonansowych.
• Ustalanie sekwencji sprzezen nie wymaga pomiarów
  stalych sprzezenia.
• WADY
• Ustalenie sekwencji sprzezen wymaga
  przeprowadzenia kilku eksperymentów.
• Moze zostac przeprowadzone jedynie na protonach
  znacznie rózniacych sie przesunieciem chemicznym.

10
EPEISODION ISPINOWO-SPINOWE SPRZEZENIAHOMOJADRO
WE w 2DCOSY CORRELATED SPECTROSCOPYTOCSY
TOTAL CORRELATED SPECTROSCOPY
11
COSY
widmo 1H
diagonala
sygnal autokorelacyjny
sygnal korelacyjny (crosspeak)
os wtórna (F1)
os pierwotna (F2)
12
COSY
A
D
C
B
A
B,A
C
D
A,B
B
13
COSY
A
D
C
B
A
B,A
C
D
A,B
B
C,B
14
COSY
A
D
C
B
A
B,A
C
D
A,B
B
C,B
D,B
15
COSY
A
D
C
B
A
B,A
C
D
C,D
A,B
B
C,B
D,B
16
COSY
A
D
C
B
A
B,A
C
D
C,D
A,B
B
C,B
D,B
17
COSY
18
COSY
A
D
C
B
A
B,A
C
D
C,D
A,B
B
C,B
D,B
19
COSY
A
D
C
B
A
B,A

• NIEPRAWIDLOWA
• OBRÓBKA WIDMA

C
D
C,D
A,B
B
C,B
D,B
20
COSY
A
D
C
B
A
B,A

• INNY
• WARIANT OBRÓBKI

C
D
C,D
A,B
B
C,B
D,B
21
COSY

• ZALETY
• Bardzo mala róznica przesuniec chemicznych
  (nakladanie sie) sygnalów rezonansowych oraz ich
  nieczytelna multipletowosc nie przeszkadzaja (za
  bardzo) w interpretacji wyników.
• Do ustalenia sekwencji sprzezen w danym ukladzie
  spinowym wystarcza przeprowadzenie jednego
  eksperymentu.
• Stosunkowo latwe (choc nie zawsze) w wykonaniu,
  obróbce i interpretacji.
• WADY
• Interpretacja skomplikowanych widm COSY
  drastycznie zwieksza zapotrzebowanie mózgu na
  glukoze.
• Niewielka rozdzielczosc widm COSY koniecznosc
  stosowania odmian eksperymentu COSY (np.
  DQF-COSY) do badania bardziej zlozonych ukladów.

22
COSY
23
TOCSY
24
TOCSY

• ZALETY
• Duza ilosc sygnalów korelacyjnych.
• Mozliwosc szybkiego okreslenia przynaleznosci
  protonów do poszczególnych ukladów spinowych.
• Mozliwosc rozpoznania struktury ukladów spinowych
  na podstawie ilosci sygnalów korelacyjnych badz
  obecnosci sygnalów rezonansowych protonów
  charakterystycznych.
• WADY
• Duza ilosc sygnalów korelacyjnych.

25
COSY
protony amidowe 7-8 ppm sprzezenie skalarne z
a
26
TOCSY
protony amidowe 7-8 ppm sprzezenie skalarne z
a
27
STASIMON I SPINOWO-SPINOWE SPRZEZENIA
HETEROJADROWE
28
SPRZEZENIE 1H-19F
-CH3
-CH2-
2JH,F 40-50 Hz
4JH,F 4-5 Hz
29
SPRZEZENIE 1H-13C
H
3JH,H
99
dublet
1JH,C
dublet dubletów
1
1JH,C
widmo 1H NMR
linie satelitarne (sidebands)
1JH,C 115-270 Hz
99
d ppm
30
SPEKTROSKOPIA 13C NMR

• 1H DECOUPLING SPRZEZENIE 13C-1H PRZEZ JEDNO
  WIAZANIE

1JC,H 110-320 Hz
31
SPEKTROSKOPIA 13C NMR

• SPRZEZENIE 13C-1H PRZEZ WIELE WIAZAN

2,3JC,H 0-60 Hz
32
SPEKTROSKOPIA 13C NMR

• DEPT (DISTORIONLESS ENHANCEMENT BY POLARIZATION
  TRANSFER)

CH3
CH2
CH
CHX
C
33
SPEKTROSKOPIA 13C NMR
d ppm typ C
2 50 sp3 (alkanowy)
50 90 sp3 (C-O), sp1
90 110 sp3 (O-C-O)
110 150 sp2 (nie CO)
gt 160 sp2 (CO)
34
SPRZEZENIE 13C-19F (CIEKAWOSTKA!)

• WIDMO 13C NMR, 1H-DECOUPLING, BRAK 19F-DECOUPLING

-CH3
-CH2-
CO
35
EPEISODION IISPINOWO-SPINOWE SPRZEZENIAHETEROJA
DROWE w 2DHSQC HETERONUCLEAR SINGLE-QUANTUM
COHERENCEHMBC HETERONUCLEAR MULTIPLE BOND
CORRELATION
36
HSQC
37
HSQC
38
HMBC
H3,C1
H1,C3
H1,C2
39
1H-13C HSQC, 1H-13C HMBC

• ZALETY I ZASTOSOWANIE
• 1H-13C HSQC pomocne przy rekonstrukcji
  izolowanych ukladów spinowych jader 1H
  (bezlitosnie wskazuje diastereotopowe grupy
  CH2).
• 1H-13C HSQC pozwala na pelne przyporzadkowanie
  sygnalów rezonansowych w widmie 13C NMR.
• 1H-13C HMBC pozwala na plynne poruszanie sie
  pomiedzy izolowanymi ukladami spinowymi jader 1H.
• WADY
• 1H-13C HMBC nie wszystkie teoretycznie mozliwe
  sygnaly korelacyjne pojawiaja sie w widmie. ICH
  BRAK NIE JEST DOWODEM NA NIEPOPRAWNOSC ZALOZONEJ
  STRUKTURY!

40
STASIMON IIDIPOLARNE SPRZEZENIAHOMOJADROWENOE
NUCLEAR OVERHAUSER EFFECT
41
NOE
Jadrowy efekt Overhausera zjawisko wzmocnienia
(badz oslabienia) sygnalu rezonansowego protonu,
który znajduje sie blisko w przestrzeni protonu
naswietlanego.
NOE
NOE
Zasieg efektu Overhausera ok. 4 Å. Jego
wystapienie jest dowodem bliskosci jader w
przestrzeni.
42
NOE
NOE
NOE
43
EPEISODION IIIDIPOLARNE SPRZEZENIAHOMOJADROWE
w 2DNOESY NUCLEAR OVERHAUSER EFFECT
SPECTROSCOPY ROESY ROTATING-FRAME OVERHAUSER
EFFECT SPECTROSCOPY
44
NOESY/ROESY
45
NOESY/ROESY

• ZASTOSOWANIE
• Eksperymenty bardzo uzyteczne przy analizie
  konformacyjnej.
• Wygodna metoda ustalania konfiguracji wzglednej
  centrów asymetrii, a niekiedy konfiguracji
  absolutnej.

NOE
NOE
46
NOESY/ROESY

• ZASTOSOWANIE
• Eksperymenty bardzo uzyteczne przy analizie
  konformacyjnej.
• Wygodna metoda ustalania konfiguracji wzglednej
  centrów asymetrii, a niekiedy konfiguracji
  absolutnej.
• Wygodna metoda ustalania sekwencji aminokwasów w
  polipeptydach, a takze sekwencji zasad w
  niewielkich odcinkach kwasów nukleinowych.

47
NOESY/ROESY

• ZASTOSOWANIE
• Eksperymenty bardzo uzyteczne przy analizie
  konformacyjnej.
• Wygodna metoda ustalania konfiguracji wzglednej
  centrów asymetrii, a niekiedy konfiguracji
  absolutnej.
• Wygodna metoda ustalania sekwencji aminokwasów w
  polipeptydach, a takze sekwencji zasad w
  niewielkich odcinkach kwasów nukleinowych.
• WADY
• Nie wszystkie teoretycznie mozliwe sygnaly
  korelacyjne pojawiaja sie w widmie. ICH BRAK NIE
  JEST DOWODEM BRAKU BLISKOSCI JADER ATOMOWYCH W
  PRZESTRZENI!

48
STASIMON IIIZESTAWIENIE WIDM 2D
49
ZESTAWIENIE WIDM 2D
eksperyment typ korelacji typ sprzezenia
COSY homojadrowe skalarne
TOCSY homojadrowe skalarne
HSQC heterojadrowe skalarne
HMBC heterojadrowe skalarne
NOESY homojadrowe dipolarne
ROESY homojadrowe dipolarne
skalarne spinowo-spinowe dipolarne
przez przestrzen.
50
EKSODOSZAWIJANIE SYGNALÓW
51
ZAWIJANIE SYGNALÓW
Szerokosc okna spektralnego zakres
czestotliwosci, w którym wykonano pomiar.
CH3
(CH3)2CO, 13C NMR
d 205,7 ppm
CO
CDCl3
zawiniety sygnal CO
Szerokosc okna spektralnego 200 ppm.
d 5,7 ppm
52
ZAWIJANIE SYGNALÓW
Szerokosc okna spektralnego zakres
czestotliwosci, w którym wykonano pomiar.
CH3
(CH3)2CO, 13C NMR
d 205,7 ppm
CO
CDCl3
zawiniety sygnal CO
Szerokosc okna spektralnego 190 ppm.
d 15,7 ppm
53
ZAWIJANIE SYGNALÓW
Szerokosc okna spektralnego zakres
czestotliwosci, w którym wykonano pomiar.
CH3
(CH3)2CO, 13C NMR
d 205,7 ppm
CO
CDCl3
zawiniety sygnal CO
Szerokosc okna spektralnego 150 ppm.
d 55,7 ppm
54
ZAWIJANIE SYGNALÓW
Szerokosc okna spektralnego zakres
czestotliwosci, w którym wykonano pomiar.
CH3
(CH3)2CO, 13C NMR
d 205,7 ppm
CO
CDCl3
Szerokosc okna spektralnego 120 ppm.
brak sygnalu CO
55
ZAWIJANIE SYGNALÓW
drzeczywiste dsygnalu zawinietego szerokosc
okna spektralnego dsygnalu zawinietego
drzeczywiste - szerokosc okna spektralnego
Uwaga szerokosci okna spektralnego nie nalezy
utozsamiac z szerokoscia skali wydruku. Te dwie
wielkosci sa sobie równe tylko wtedy, jesli widmo
zostalo wydrukowane w calym zakresie pomiarowym.
56
DZIEKUJE ZA UWAGE! (...i powodzenia na kolokwium)