Lezione 17 - 18 mercoled

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Lezione 17 - 18mercoledì 27 aprile 2011
corso vettori biologici II Biotec industriali ore
1400 -1600 aula 6A
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Clonaggio dei prodotti PCR
Clonaggio in plasmidi dedicati con prodotti
PCR con TAQ polymerase w.t. si hanno aggiunte
di A terminali spuri TAQ proof reading o altri
producono ampliconi blunt ends Secondo che
enzima si usa, si sceglie un plasmide
adeguato. Esistono in vendita - plasmidi gia
linearizzati con coda di T terminale per
facilitare la ligasi tra lamplicone ed il
plasmide - plasmidi con topoisomerasi coniugata
allestremita del plasmide che attacca
direttamente lamplicone senza bisogno di ligasi
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cerchiamo delle estremità ad un frammento di PCR
intersperso allinterno di una sequenza ignota

• se ho trovato da Southern un frammento di DNA a
  sequenza ignota (però conosco la sonda),
• una inserzione di un frammento noto in un
  genoma,
• un vettore che si è integrato in una regione
  ignota,
• un virus integrato non sito specifico,
• una ricerca gene trapping,
• la ricerca delle estremità genomiche di un gene
  noto solo come cDNA

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la soluzione è la PCR inversa
Si ha un ancoraggio sulla sequenza nota e
nientaltro Si deve amplificare in maniera
inversa rispetto ad una PCR normale Quale
stratagemma si usa? Circolarizzare un frammento
dopo analisi di restrizione per Southern
utilizzando la sequenza nota come sonda Il
templato può essere un frammento proveniente da
una delle possibili analisi precedenti
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analisi Southern del frgm
deve essere scelto il frammento da amplificare
sequenza genomica o di Bac o da cui si vuole
recuperare la sequenza nota inserita o integrata
digestione con enzimi di restrizione
verde no buono bleu no buono giallo no
buono viola troppo lungo marrò buono rosso
buono grigio viola buono
- tra due buoni si sceglie quello con estremità
coesive per la ligasi più efficiente - si evita
lenzima che taglia allinterno del frgm, si
otterrebe solo una estremità (diversa strategia)
grigio viola se dx troppo lungo, estremità
compatibili
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dopo lanalisi Southern

• Dopo lindividuazione del frammento di ampiezza
  conveniente
• digestione del DNA con lenzima prescelto
• arricchimento del frammento con corsa su gel
  (opzionale)
• ligasi
• PCR con primers divergenti
• eventualmente seconda PCR con primers nested
  ancora più esterni ai primi, ma interni al frgm
  lineare
• una PCR produce sempre frgm lineari !!!!

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PCR inversa
Il nome deriva dal fatto che si usano primers
disegnati su una sequenza con direzione
divergente, direzione di sequenza dei primers
apparentemente non convergente. Analisi Southern
Frammento di DNA
A
B
c d Sequenza nota (primers
divergenti)
seq ignote
seq ignote
Ligasi per circolarizzare il frammento
si amplifica il frammento circolare nella regione
ignota
Sequenza nota
C D
primers divergenti
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amplificazione di DNA genomico o clonato
al primo ciclo cosa si amplifica ?
la Taq polimerase si ferma sullamplicone ?
la taq polimerasi non ha ostacoli e non si ferma
primer frw
allora ? perchè si amplifica solo lamplicone ?
primer rev
termini dellamplicone
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Orientamento primers PCR inversa
ligasi del sito di restrizione
a
b
5
3
3
5
3
5
c d
3
5
3
5
c
b
a
d
5
3
d
a
b
c
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PCR nested per PCR inversa
estremità ignote digerite su DNA genomico e legate
regione nota
II primer
II primer
I coppia divergente
I primers dovranno sempre essere complementari
ai due diversi filamenti
PCR nested quando si vuole ottenere maggiore
specificità
I amplicone
I primer
I primer
II primer
II amplicone
II primer
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Primo ciclo frgm lungo
frammento di restriz legato
c
c-d sequenza nota
d
I ciclo
c
c
d
d
II ciclo
c
d
c
c
d
d
possibilità di concatenamero se la taq prosegue
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si amplifica solo lamplicone
la taq polimerasi non ha ostacoli e non si ferma
primer frw
primer rev
dal II ciclo compare il frammento con le
estremità corrispondenti al 5 dei due primers
primer rev
templato I amplificaz
templato I amplificaz
primer frw
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il prodotto di PCR è sempre lineare
sia nella PCR diretta che inversa con un DNA
circolare
provate a farvi uno schema!
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Metodo real time
Differenza con PCR standard end point
end point si intende reazione a termine
Analisi dellamplificazione in tempo reale
Tramite fluorescenza dei prodotti amplificati
Colorante fluorescente del DNA intercalante
CYBRgreen
Marcatura dei primers o doppia sonda FRET
TaqMan amplifluor
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Principio del funzionamento real-time
Analisi dellamplificazione ad ogni ciclo
lettura laser della fluorescenza (qualunque
metodo)
Soglia di superamento rumore di fondo
1pg
Inizio crescita log macchina tra 35-40 cicli
10pg
5pg
Curva sigmoide Effetto inibiz.
0.5pg
determinazione di sensibilità del metodo
no DNA
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1 log per 3.3 cicli
ogni tre,tre cicli 10 x incremento
Crescita a esponente 2
f l u o r.
Intercetta col cut off background punto
inizio log phase determinabile
La conc. Misurata con una curva standard di
riferimento x condizioni
n. cicli
Ascissa n. cicli / ordinata fluorescenza
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AFLP Amplified restriction fragment lenght
polymorphisms
Ogni genoma ha un certo numero di siti di
restrizione per tipo di enzima di restrizione -
si digerisce il genoma e ci si legano degli
adapters - si disegnano dei primers che
contengono ladapter ed una sequenza random al 3
con due, tre, quattro, cinque, sei nucleotidi
secondo quanto si vuole essere selettivi da
migliaia di frammenti si passa a meno di cento -
Gli oligonucleotidi verso il 3 oltre ladapter
possono contenere solo certi nucleotidi e allora
sono piu selettivi e diminuiscono il numero di
frammenti specifici rendendo il pattern piu
semplice da analizzare.
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Dagli RFLPs agli AFLPs
Nuovo metodo di studio dei polimorfismi con
approccio globale genomico Studio dei
polimorfismi di frammenti di restrizione non
conosciuti con amplificazione tramite PCR
selettiva dei frammenti genomici
http//www.dea.gov/programs/forensicsci/microgram/
journal071203/mj071203_pg7.html
Approccio globale con micro-cips
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Polimorfismo dei frammenti di restrizione
amplificati (AFLP)
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Schema dei primers usati

• Produzione in multiplex di 50-100 marcatori con
  un singolo esperimento.
• Produzione contemporanea di bande polimorfiche
  tra individui (DNA fingerprinting) e di
  monomorfiche entro e polimorfiche tra specie
  (identificazione di specie)
• Applicabili al genoma di qualsiasi specie senza
  bisogno di informazioni a priori sulle sequenze o
  di disponibilità di sonde

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Fasi dellesperimento
! digestione con Eco RI del genoma in analisi !!
digestione della I reazione con Taq I (o altro
enzima) !!! ligasi con la miscela dei due
adattatori !!!! preamplificazione senza
marcatura !!!!! amplificazione con primers
marcati !!!!!! corsa su gel di acrilamide
4,5 !!!!!!! rivelazione con autoradiografia o
elettroforesi capillare in alternativa corsa
elettroforetica capillare con fluorescenza
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Adattatori e Primers
Adattatori secondo il metodo pubblicato da Pieter
Vos et al. Nucl.Acid Res. 1995, 23 n.21,
4407-4414 e Paolo Ajmone-Marsan et al. Animal
Genetics 1997, 28, 418-426.
adattatore Eco RI
5 3
5 3
CTGGTAGACTGCGTACC AATTCnnnnnnnnG
AATTGGTACGCAGTCTAC CATCTGACGCATGGTTAA
 GnnnnnnnnCTTAA CCATGCGTCAGATGGTC 3
5 3
5 adattatore Eco RI frammento di
restrizione adattatore Taq I
GACGATGAGTCCTGAC CGAnnnnnnnnnnnnnT
CGGTCAGGACTCAT
TACTCAGGACTGGC TnnnnnnnnnnnnnAGC CAGTCCTGAGTAGCAG
adattatore Taq I e terza
combinazione con adattatori Eco e Taq sui
frammenti tagliati regolarmente
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Elettroforesi su acrilamide
Ogni lane è un soggetto Il n. di bande presenti
costituisce il pattern allelico Alcuni alleli
sono molto frequenti (strisce orizzontali)
possono caratterizzare la razza animale
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AFLPs gel acrilamide
PCR-based screening of BAC DNA pools for SAS-DNA
markers using AFLP technology. AFLP templates
were prepared from BAC DNA PPs (1-32) and SPs
(1-16) and selectively amplified with
fluorescent-labeled EcoRI TGA and MseI CGG.
Labeled products were analyzed on a LI-COR DNA
sequencer. AFLP template from genomic DNAs
(IS3620C and BTx623) were run as controls and are
indicated above the respective lanes. Arrows to
the right of the gel show selected SAS DNA
markers that were analyzed in the DNA pools.
Asterisks to the right of a subset of the markers
indicate those SAS DNAs that revealed
polymorphisms between BTx623 and IS3620C and
could be mapped as AFLPs on the sorghum genetic
map. Fluorescent-labeled molecular weight markers
(LI-COR) were run in lanes marked M and their
sizes (bp) are shown to the left of the gel.
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Elettroforesi capillare
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cosa è unaNested PCR
Per aumentare la specificità con PCR ottimizzata
e non ulteriormente ottimizzabile con i parametri
di reazione
Se si deve avere un prodotto di amplificazione
con alta efficienza eliminando altri prodotti
indesiderati -a) omologia parziale dei primers
già ottimizzati -b) sequenze omologhe,
pseudogeni, sequenze duplicate caso a trovare
una seconda coppia di primers interni al primo
amplicone (probabilità limitata di omologia di
entrambe le sequenze in una stessa regione) caso
b cercare le regioni divergenti dove scegliere
altre coppie di primers
II amplicone interno
primer frw. I
primer frw. II
primer rev.I
primer rev.II
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PCR nested primo esempio
Quando abbiamo un amplicone per esempio di 500 bp
pr frw
5
3
5
3
3
5
5
3
pr rev
1 amplicone
II pr frw
5
3
5
3
II pr rev
2 amplicone nested
il secondo amplicone sarà più breve secondo la
posiz. dei primers
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esercizio
1 CTCAGAGCTG GGAAGGAGGC TCTAGATGGC
GGCTGTGCCT TAGAGAGAGC GCGCTCTGCT 61
CCCTGCCTTT GCCTCACTTT ACGCAACTTT CCCTAACTTT
CGGGCAGCCT CAGGGGGCCC 121 CCGTAGCCCC
CTGCCTTTCC TAGGGACTTA CTGGGGTCGA TTCGAACCTT
TTTTTGGGAG 181 AAAAGCAGCT TTTAGGAGCT
TTCTTTTCGT GCCTTGTTGG AAAGAAGCAG CCGTACTGAG
241 AGCCCAGGTC GTTGTTTTTT CCAGCTTAGA AGCCATGGCG
CACCTCCATT TTTGTGCGCT 301 CTCCTAATGA
GGTTTTTTTT CTTTCGGACC TGTTTTAGTA TTAATTATTG
CTTTATTTTT 361 TTGACCAGTT AACATATTTG
AGGGTTATTT TATTTATTTT TCGTTTTTTA ACGGAGGATT
421 TTGCCTTTAT TTTTAATTAT TTGGGATCTG ATATTTTTCT
ACTAGTAGAT AGGACTCTTG 481 GTTTGGACAT
ACTACATGGA TCAGTAAATA CCTGGGCACA GGACTTCAAA
GCAAACACAG 541 ATTCCCCCTC CCCCTTAATA
TTTAAGAATT AAAAGATGAT GAGAAATAAG GACAAAAGCC
601 AAGAGGAGGA CAGTTCGCTA CACAGCAATG CATCGAGTCA
CTCAGCCTCT GAAGAAGCTT 661 CGGGTTCAGA
CTCAGGCAGT CAGTCGGAAA GTGAGCAGGG AAGTGATCCA
GGAAGTGGAC 721 ATGGCAGCGA GTCGAACAGC
AGCTCTGAAT CTTCTGAGAG TCAGTCGGAA TCTGAGAGCG
781 AATCAGCAGG TTCCAAATCC CAGCCAGTCC TCCCAGAAGC
CAAAGAGAAG CCAGCCTCTA 841 AGAAGGAACG
GATAGCTGAT GTGAAGAAGA TGTGGGAAGA ATATCCTGAT
GTTTATGGGG 901 TCAGGCGGTC AAACCGAAGC
AGACAAGAAC CATCGCGATT TAATATTAAG GAAGAGGCAA
961 GTAGCGGGTC TGAGAGTGGG AGCCCAAAAA GAAGAGGCCA
GAGGCAGCTG AAAAAACAAG 1021 AAAAATGGAA
ACAGGAACCC TCAGAAGATG AACAGGAACA AGGCACCAGT
GCAGAGAGTG

• Trova i primers per fare una PCR di un frammento
  di circa 3- 400 bp di questa sequenza,
• - trova i primers per una PCR nested.
• - Trova i primers per una PCR inversa e nested
• - Trova a che gene appartiene questa sequenza

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esecuzione esercizio
1primer forward da b.72 a 92 21 basi 10 GC,
11 AT 4022 T melting 62C 1primer reverse
da 786 a 767 20 basi 10 GC, 10 AT 40 20
T melting 60C amplicone 715 bp (da 72 a
786) nested 2 forward da b. 121 a 140 20
basi 14 GC, 6 AT 56 12 T melting 68C
2 reverse da b. 520 a 498 23 basi 11 GC, 12
AT 44 24 T melting 68C amplicone 400
bp (da 121 a 520)
Il gene ? andare su nucleotide dalla banca dati
http//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
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esercizio II parte
PCR inversa dopo aver analizzato per Southern la
regione si sceglie lenzima di restrizione per
avere un frammento di circa 4-6 kb scelta dei
primers 2 e 1 primer forward invertiti (rev.
compl.) del 1 amplicone 1 primer rev inv. e
2 da b. 961 a 982 cerca la sequenza in banca
dati su sito NCBI http//www.ncbi.nlm.nih.gov/bla
st/Blast.cgi nucleotide blast UniGene
infoGeoGene info Homo sapiens chromodomain
helicase DNA binding protein 2 (CHD2), transcript
variant 1, mRNA Length9374
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segnare i primers
1 CTCAGAGCTG GGAAGGAGGC TCTAGATGGC GGCTGTGCCT
TAGAGAGAGC GCGCTCTGCT 61 CCCTGCCTTT GCCTCACTTT
ACGCAACTTT CCCTAACTTT CGGGCAGCCT CAGGGGGCCC 121
CCGTAGCCCC CTGCCTTTCC TAGGGACTTA CTGGGGTCGA
TTCGAACCTT TTTTTGGGAG 181 AAAAGCAGCT TTTAGGAGCT
TTCTTTTCGT GCCTTGTTGG AAAGAAGCAG CCGTACTGAG 241
AGCCCAGGTC GTTGTTTTTT CCAGCTTAGA AGCCATGGCG
CACCTCCATT TTTGTGCGCT 301 CTCCTAATGA GGTTTTTTTT
CTTTCGGACC TGTTTTAGTA TTAATTATTG CTTTATTTTT 361
TTGACCAGTT AACATATTTG AGGGTTATTT TATTTATTTT
TCGTTTTTTA ACGGAGGATT 421 TTGCCTTTAT TTTTAATTAT
TTGGGATCTG ATATTTTTCT ACTAGTAGAT AGGACTCTTG 481
GTTTGGACAT ACTACATGGA TCAGTAAATA CCTGGGCACA
GGACTTCAAA GCAAACACAG 541 ATTCCCCCTC CCCCTTAATA
TTTAAGAATT AAAAGATGAT GAGAAATAAG GACAAAAGCC 601
AAGAGGAGGA CAGTTCGCTA CACAGCAATG CATCGAGTCA
CTCAGCCTCT GAAGAAGCTT 661 CGGGTTCAGA CTCAGGCAGT
CAGTCGGAAA GTGAGCAGGG AAGTGATCCA GGAAGTGGAC 721
ATGGCAGCGA GTCGAACAGC AGCTCTGAAT CTTCTGAGAG
TCAGTCGGAA TCTGAGAGCG 781 AATCAGCAGG TTCCAAATCC
CAGCCAGTCC TCCCAGAAGC CAAAGAGAAG CCAGCCTCTA 841
AGAAGGAACG GATAGCTGAT GTGAAGAAGA TGTGGGAAGA
ATATCCTGAT GTTTATGGGG 901 TCAGGCGGTC AAACCGAAGC
AGACAAGAAC CATCGCGATT TAATATTAAG GAAGAGGCAA 961
GTAGCGGGTC TGAGAGTGGG AGCCCAAAAA GAAGAGGCCA
GAGGCAGCTG AAAAAACAAG 1021 AAAAATGGAA ACAGGAACCC
TCAGAAGATG AACAGGAACA AGGCACCAGT GCAGAGAGTG
1 frw 2 inv 2 frw 1 inv
2 rev
1 rev 1 inv
2 inv
inv primer per PCR inversa che ha due coppie di
primers per poter fare una PCR nested, quelli al
5 della seq. devono essere complementary-reverse
e quelli al 3 sono uguali alla sequenza stampo
data
32
primers con code!
la regione di annealing deve essere efficiente
sul 3
5
3
la coda verrà inserita e dal ciclo successivo
fara parte dellamplicone
5
3
templato
3
5
amplicone con coda incorporata
33
se i primers hanno la coda
5
3
5
3
3
5
5
3
3
3
5
5
alla polimerase importa solo che il 3 sia
appaiato, però la coda del primer sarà
incorporato e farà parte dellamplicone è la
stessa cosa che succede in una amplificazione
aspecifica in cui solo il 3 del primer
(specifico) trova omologia di sequenza e farà
amplificare un prodotto non specifico
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Mutagenesi tramite uso di primers modificati
Per fare avvenire una delezione o inserzione si
utilizza il metodo a tre passaggi (esempio per
inserzione).
per inserire la sequenza mutata nella sequenza
voluta o si seleziona un ricombinante dopo
trasfezione o si inserisce direttamente la
sequenza mutagenizzata con enzimi di restrizione.
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Mutagenesi con PCR in tre passaggi
DNA mitocondriale bovino acc. N. V00654, gi 12800
con 16338 bp L8014 (external forward primer)
5-ACCCATTGTCCTTGAGTTAGT-3, H8393 (external
reverse primer) 5-GAGGGTTACAAAGCGATTGCT-3,
H8242 (internal reverse primer)
5-GAGATCTGCCGTACAGGCCTAGAATATTTTTGTTGGTGTCAGT-3
and L8283 (internal forward primer)
5-CTAGGCCTGTACGGCAGATCTCAAAACAAAACACCCCTTGAGA-3
, III PCR per estensione della regione
sovrapposta I primers interni L8283 e H8242 hanno
una coda al 3-terminale che è stata usata per
introdurre una inserzione di 22 bp (parte
sottolineata nella sequenza del primer). La
complementarietà sta nellinserzione tra il 3
dellint. frw. primer ed il 5 dellint.rev.primer
Linserzione permette di discriminare per peso
molecolare la sequenza bovina da quella del
nuovo costrutto usato nella PCR competitiva come
riferimento con varie diluizioni a partire da una
concentrazione nota. Il competitore sintetico è
stato clonato nel vettore pBlueScript KS della
ditta Stratagene (La Jolla, Ca.CA USA).
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Complementarietà delle code
H8242 (internal reverse primer)
5-GAGATCTGCCGTACAGGCCTAGAATATTTTTGTTGGTGTCAGT-3
and L8283 (internal forward primer)
5-CTAGGCCTGTACGGCAGATCTCAAAACAAAACACCCCTTGAGA-3
seq mitoc. spec
coda per appaiamento
5-CTAGGCCTGTACGGCAGATCTCAAAACAAAACACCCCTTGAGA- 3
3TTTTATAAGATCCGGACATGCCGTCTAGAG
5
seq mitoc. spec
5
3 int rev pr
templato
5
3
5
3
5
int frw pr
3
3
5
templato
37
appaiamento PCR I II
38
inserzione
di un frammento f in un amplicone (3 steps 3
passaggi)
39
delezione
di un frammento b da un amplicone
frw
frw
1
2
a
c
b
primer 1 e 2 interni iniziano e finiscono sui
limiti della sequenza da deletere
2
1
rev
rev
b
3libero
oredil 3
a
c
delezione
2
1
c
a
c
annealing II PCR
2
2
1
a
2
1
40
sostituzione
in un amplicone in 3 passaggi
5
z
a
I
c
II
b
II PCR separate
3
5
z
5
z
a
annealing III PCR ed extension
3
c
5
5
3
z
III
z
a
c
PCR finale
5
3
3
5
41
giunzione di due frammenti distanti
la procedura è la stessa di quella della
delezione, la differenza consiste nella
collocazione del secondo amplicone che si vuole
legare al primo che può essere ovunque nel
genoma, unica condizione necessaria è la presenza
delle code complementari dei primers che è
obbligatoria, basta scegliere quale sequenza va
al 5 e quale al 3 del nuovo amplicone
artificiale
x
y
42
quali code sono produttive ?
A) code compl. rev
3
3
gg
x
aa
x
5
y
cc
5
5
tt
cc
aa
gg
3
aa
3
5
tt
5
cc
ordine del prodotto x - y
strand /-
3
B) code rev.
perchè non funge?
aa
x
5
cc
3
3
cc
cc
y
5
y
gg
5
3
aa
aa
5
tt
tt
3
5
gg
43
altre code
code al 3 e 5
5
cc
aa
x
si
y
5
3
aa
cc
tt
gg
3
5
no
gg
tt
3
5
verso x - y strand / dirette
code invertite al 5
5
5
cc
tt
no
y
x
3
3
aa
gg
tt
si
cc
5
5
gg
aa
3
3
verso y - x strand /- invertite
44
Applicazioni dellultimo metodo
Questo terzo metodo che abbiamo visto, può essere
utilizzato sia per ottenere inserzioni o
sostituzioni, ma anche delezioni però con
linserzione di un nuovo frammento di lunghezza
diversa, anche molto diversa per avere una
regione di omologia per lappaiamento ed
elongation. Dipende da dove si fanno partire i
primers interni con la coda. In realtà si possono
giuntare anche frammenti non limitrofi per
costruire geni di fusione. Si possono legare
esoni di geni diversi come per esempio esoni di
un gene a cui attaccare la GFP o Lac Z.
45
riepilogo
RT-PCR nested PCR mutagenesi