IN VITRO

1
IN VITRO TESTIEN KEHITYSTILANNE

• Hanna Tähti
• Tampereen yliopisto
• Solututkimuskeskus
• REACH-seminaari 03.11.2005, Helsinki

2
TAUSTA
LÄÄKKEET, KEMIKAALIT, PESTISIDIT, KOSMETIIKKA
3
TAUSTA
LÄÄKKEET, KEMIKAALIT, PESTISIDIT, KOSMETIIKKA
EU -kauppa
ihmisen ympäristön turvallisuus ?
Toksikologinen riski
4
LÄÄKKEET, KEMIKAALIT, PESTISIDIT, KOSMETIIKKA
EU -kauppa
ihmisen ympäristön turvallisuus ?
Toksikologinen riski
IN VIVO koe-eläimet
Epidemiologinen tieto Kliininen tieto (Q)SAR,
Physikaalis-kem. ominaisuudet
5
Koe-eläinten käyttö EUssa

• Yhteensä 10 700 000 v. 2002
• Turvallisuusarviointi 1 060 000 10
• Maatalouskemikaalit 123 000 1
• Teollisuuden kemik. 136 000 1
• Kosmetiikkateollisuus 2 700 0,025

6
Eläinten käyttö toksikologiassa 1999
3
3rd Commission Report on the Number of Animal
Used in the EU
7
In vitro-testien kehitykseen vaikuttavat tekijät

• In 1986, the Council of Ministers Direktiivi
  86/609/EEC
• 3-Rs
• Reduction, Refinement, Replacement
• 1991 ECVAM
• 2003 7th amendment of cosmetics directive
  76/768/EEC
• Ban on animal testing for finished products
• 2009 for cosmetic ingredients
• Marketing ban on cosmetics tested on animals
  where alternative methods exist
• REACH

8
Registration, Evaluation, Authorisation of
Chemicals

• REACHin on arvioitu lisäävän koe-eläinten
  käyttöä
• Testausvaatimus perustuu painoluokkiin, eikä
  esim. altistumistodennäköisyyteen
• 30 000 kemikaalia (tuotanto gt 1tn/vuosi) tulee
  testata 11 vuoden kuluessa
• gt1000 tn 2700 kemikaalia
• 100-1000 tn 2500 kemikaalia
• 10-100 tn 5000 kemikaalia
• 1-10 tn 20 000 kemikaalia

9
REACH 30,000 kemikaalia gt 1 t/vuosi

• Medical Research Council UK ( 2001) arvioi
  kustannukset ja keston, jos käytetään pelkästään
  eläinkokeita
• Financial cost 9 billion
• Animals 13 million
• Timescale for 1-100 t 2048
• for 100-1000 t 2024
• for 1000 t 2018

10
Eun arvio koe-eläinten määrästä

• van der Jagt et al. (2004) Alternative
  approaches can redusce the use of test animals
  under REACH.-European Commission JCR Report.
• Animals 2,1- 3,9 milj.
• Costs 1143 2274 milj.
• Underestimation?
• Grindon, C., Combes, R. and Balls, M. The
  scientific, animal welfare and regulatory
  implications of the EU REACH system for chemical
  safety. Regulatory Rapporteur, April 2005.
  www.topra.org

Validoitujen vaihtoehtomenetelmien tarve on
lisääntynyt REACHin myötä
11
Validointi

• Validointi on tutkimus, jossa testi arvioidaan
  tieteellisesti toisistaan riippumattomien
  laboratorioiden toimesta seuraavien
  ominaisuuksien suhteen
• Luotettavuus (reliability)
• Toistettavuus (repeatability)
• Relevanssi (relevance)
• tieteellinen pätevyys
• ennustavuus

Laatu (GLP, GCCP) Systemaattiset katsaukset,
meta-analyysi
12
Testin kehittäminen ja validaatio

• Euroopassa validaatiota koordinoi ECVAM (European
  Centre for Validation of Alternative Methods)
• USAssa ICCVAM (Interagency Co-ordinating
  Committee on the Validation of Alternative
  Methods)
• Japanissa JaCVAM (Japanese Center for Validation
  of Alternative Methods)

Validaatiotutkimuksen edellytyksiä Laatu (GLP,
GCCP) Systemaattiset katsaukset, meta-analyysi
13
Testimenetelmän validointi
Test chemicals
Reference data Consensus standard
14
Ohjeistoihin hyväksytyt in vitro vaihtoehtotestit

• Genotoksisuustesti (Amesin testi, 1982, OECD)
• Valotoksisuustesti (373 NRU)
• EU, 67/548/EEC/B.41, 2000
• OECD, 432, 2002
• Ihokorroosiotesti (EpiDermTM, Rat TER, EpiSkinTM)
• EU, 2000
• OECD (431), 2002
• Iholäpäisevyystesti
• OECD (428), 2002

Replacements
15
Hyväksyttyjä/kehitteillä

• Ihon herkistävyystesti (LLNA)
• OECD (429), 2002, refinement,reduction
• Lisäksi testejä
• rokotteiden testaukseen
• pyrogeenisuuden testaukseen
• useita validoituja testejä, jotka eivät vielä
  ohjeistoissa

• Integroituja testausstrategioita, joita ei ole
  validoitu,
• useille vaikutuksille
• akuutti letaali toksisuus
• iho- ja silmä-ärsytys
• neurotoksisuus
• karsinogeenisuus

Refinement, reduction
16
IhokorroosioEpiSkin, RatTER, EpiDerm

• OECD 431
• Testiaine annostetaan iholle
• Mitataan vaikutus solujen elävyyteen

• EpiDermTM

3-ulotteinen ihmisen ihomalli
Validoitu 1988 60 kemikaalia, 3
testilaboratoriota, 3 testiä Hyväksytty EU
2000, OECD 2002
17
Ihoärsytys - Draizen ihotestiä korvaava testi

• EPISKIN osoittautunut paremmaksi malliksi kuin
  EPIDERM
• Ei erottele hyvin ei-ärsyttäviä, ja lievästi
  ärsyttäviä kemikaaleja
• Solutoksisuuden lisäksi arvioidaan spesifisempiä
  markkereita
• sytokiinien vapautuminen (IL- 1a)
• geeniekspressio

Validaatio 2004-2005
18
Silmä-ärsytys Draizen kanin silmä-ärsytystestiä
korvaavat testit

• Eristetty naudan silmä in vitro (BCOP)
• Eristetty kanin silmä in vitro (IRE)
• Eristetty kananpojan silmä (ICE)
• HET-CAM kananmunan alkio (chorion-allantois)

Validaatio epäonnistui EC/HO, 1995 COLIPA, 1997)
Seuraava vaihe Meta-analyysi ECVAM-ICCVAM
retrospektiivinen validaatio 2006-2007
19
3-ulotteinen malli
Ihmisen solulinjojen yhdistelmäviljelmä
20
Portaittainen testausstrategia (Reduction)
Existing information
In vitro test 1
Non irritant
Severe irritant
In vitro test 2
Mild irritant
Confirmatory test in vivo
21
Akuutti toksisuus (Refinement, Reduction)

• LD50 testi poistettu ohjeistoista v. 2002
• Tilalla vähemmän koe-eläimiä vaativat testit
• FDT (420) 5, 50, 300, 2000 (5000) mg/kg, 5
  rottaa/annos. Määritetään alin annos, joka
  aiheuttaa toksisuuden
• ATC (423) 5, 50, 300, 2000 (5000) mg/kg, 3
  rottaa/annos. Määritetään alin annos, joka
  aiheuttaa kuoleman
• UDP (425) Aloitetaan parhaasta kuolettavan
  annoksen arviosta ja haarukoidaan LD50

22
Akuutin toksisuustestin kehitys

• 1970 - luvulla 150 eläintä/testaus
• 1980 - luvulla, OECD, TG 451 45 eläintä
• 1990 - luvulla, TG420,423,425 12-16 eläintä
• 2002 - LD50 testin poisto ohjeistoista

23
Akuutti systeeminen toksisuus in vitro

• Solutoksisuus korreloi akuuttiin toksisuuteen
• MEIC projekti 1989-1999
• korrelaatio solutoksisuusannosten ja ihmisen
  veren letaaliannosten välillä
• ECCVAM/ICCVAM validaatiotutkimus
• A-Cute-Tox projekti 2005-2010
• Tähtää uuden testisysteemin kehittämiseen akuutin
  toksisuuden luokitteluun
• 140 referenssikemikaalia
• Kerätään tietokanta (ihmis-, eläin- ja in vitro)
• In silico ja in vitro testausten kehittäminen
• Kineettisten tekijöiden huomioon ottaminen

24
MEIC (multicentre evaluation of in vitro
cytotoxicity)

• Björn Ekwall 1989-1999
• 100 laboratoriota/200 in vitro testimenetelmää/50
  kemikaalia
• 3 ihmisen solulinjaa ennustivat systeemistä
  toksisuutta paremmin kuin eläintestit
• Jatkossa haluttiin kehittää testipatteri, jonka
  osana olisi kineettisten tekijöiden arviointi ja
  eräät elintoksisuuksien määritykset
  (neurotoksikologia, munuais- ja maksatoksisuus)

25
Akuutin toksisuuden ja solutoksisuuden välinen
korrelaatio
Registry of Cytotoxicity MEIC
72 chemicals human keratinocyte cells BALB/c 3T3
fibroblasts 3 laboratories (2 in USA, 1 in EU)
26
Acute Systemic Toxicity
Integrated Project 37 partners (14 states),
granted 9 M17 universities, 10 SME, 2 industry,
6 institutes Coordinator Expertrådet, Sweden
27
Reproductive Toxicology
Integrated Project (2004-2008)26 partners (9
states), granted 9 M9 universities, 5 SME, 3
industry, 7 gov. Coordinators Univ. Tübingen /
ECVAM
28
Ihon herkistävyystesti

• Sens-it-iv (2006-2010)
• 31 partneria
• 14 M
• iho- ja keuhkoreaktiot
• in vitro strategian kehittäminen herkistymistä
  aiheuttavien kemikaalien tunnistamiseksi

29
Kehitteillä olevat testit

• Mutageenisuuden ja karsinogeenisuuden arviointiin
• mikronukleustesti, MNT (validaatio 2005)
• solutransformaatio, CTA (validaatio 2005)
• Hormonihäiritsijöiden arviointi osana
  ReProTect-projektia
• prevalidaatio alkamassa
• Toksikokinetiikka (2005)
• fysiologiaan perustuva farmakokineettinen
  mallintaminen
• suolen absorptiomalli
• veri-aivoestemalli
• metaboliamalli
• Akuutti toksisuus kalalle
• reduction alternative, peer review in 2005,
  Refinement, Reduction
• eläintestin vaihtoehdon validaatio 2006-2007
• Elintoksisuuksien arviointi
• neurotoksisuus
• munuais- ja maksatoksisuus
• Kroonisen toksisuuden arviointi
• ECVAM-Workshop 2004, suunnitelma-asteella

30
REACH

• 1-10 t/v n. 20 000 kemikaalia
• in vitro ihoärsytys/korroosio
• in vitro silmä-ärsytys/korroosio
• in vitro genotoksisuus (bakteeritesti)
• in vivo ihoherkistävyys (LLNA)
• 10-100 t/v n. 5000
• in vitro sytogeenisuus, mutageenisuus
• in vivo ihoärsytys/korroosio
• in vivo silmä-ärsytys/korroosio
• in vivo akuutti toksisuus
• in vivo 28-vrk toistuva altistus
• in vivo lisääntymistoksikologia
• in vivo toksikokinetiikka
• in vivo lyhytkestoinen kalatoksisuus

31
REACH

• 100-1000 t/v, n. 2500
• in vivo 90-vrk toistuva annostus
• in vivo teratogeenisuus, lisääntymishäiriöt
• in vivo krooninen kalatoksisuus
• bioakkumulaatio
• gt 1000t/v, n. 2700
• in vivo mutageenisuus
• in vivo lisääntymistoksikologia
• in vivo karsinogeenisuus
• in vivo pitkäaikainen toksisuus (linnuissa)

32
3Rs
Background Name Scale of use etc.
Physicochemical Properties Volatility Solubility
etc.
Existing toxicological data review
Testaus- strategiat
Yes
Testing required
No
Data sufficient for classification
Further information required
QSAR Predicted metabolism Percutaneous
absorption Corrosivity Sensitization
In vitro testing Tier 1
No
Yes
Priorities for further testing Tier 2