FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION (FISH)

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FLUORESCENT IN SITUHYBRIDIZATION(FISH)
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• La fluorescencia in situ detecta secuencia de
  ácido nucleico por una sonda fluorescente que
  hibridiza específicamente a su secuencia
  complementaria dentro de la célula intacta

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Aplicaciones

• 1 Identificación/cuantificación de organismo
  cultivables/no cultivables de muestras medio
  ambientales, dentro de organismo como
  endosimbiontes, o enriquecimientos.
• 2 Monitoreo de la dinámica poblacional en medio
  ambientes y/o enriquecimientos.
• 3 Visualización de la relación entre comunidades
  microbianas como biofilms, sludge (lodos), etc.
• 4 Identificación morfológica o relaciones en
  tipos de comunidades de microorganismos.

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Limitaciones

• 1. Cantidades decrecientes de ARNr blanco
• baja o señal nula debido a células quiescentes
  o metabólicamente inactivas
• 2. Autofluorescencia de fondo, incluye
  cianobacteria, tejidos vegetales, etc.
• 3. La permeabilidad de los tejidos o la
  dificultad de la sonda para atravesar la células
  como Gram, Archaea, etc.

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Pasos principales Fijación de la
muestra Inmobilización sobre portas Hibridización
con los oligos marcados fluorescentes Lavado del
porta (mejora la astringencia) Conteo de la cepa
con tinta no específica (como DAPI o
4',6-diamidino-2-phenylindole is a fluorescent
stain that binds strongly to DNA ) Agregado del
montante anti-blanqueo Observación bajo el
microscopio de epifluorescencia
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Características del ARNr

• Cadena simple
• Moléculas antiguas
• Funciones constantes
• Distribuido universalmente
• Filogenéticamente bien conservada

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(No Transcript)
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DAPI o 4',6-diamidino-2-phenylindole is a
fluorescent stain that binds strongly to DNA
emission maximum is at 461 nm blue/cyan DAPI
will also bind to RNA, though it is not as
strongly fluorescent. Its emission shifts to
around 500 nm when bound to RNA
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(No Transcript)
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Specific Detection of Arcobacter and
Campylobacter Strains in Waterand Sewage by PCR
and Fluorescent In Situ HybridizationYolanda
Moreno,1 Salut Botella,1 Jose Luis Alonso,2
María A. Ferrus,1 Manuel Hernandez,1and Javier
Hernandez1
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Sonda de isótopos estables
Que se está haciendo?
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PCR en tiempo real

• En la PCR a tiempo real, los procesos de
  amplificación y detección se producen de manera
  simultánea en el mismo vial.
• Además, mediante detección por fluorescencia se
  puede medir durante la amplificación la cantidad
  de ADN sintetizado en cada momento, ya que la
  emisión de fluorescencia producida en la reacción
  es proporcional a la cantidad de ADN formado.
• Esto permite conocer y registrar en todo momento
  la cinética de la reacción de amplificación.

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• Los sistemas de detección por fluorescencia
  empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de
  dos tipos
• agentes intercalantes SYBR Green
• sondas específicas marcadas con fluorocromos
  diseñados de manera especial.

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Real Time PCR

• PCR en tiempo real
• PCR cuantitativa
• PCR cinética
• Medición de la formación de un producto de PCR en
  tiempo real
• Requiere
• Fluorocrómo
• Sistema óptico de detección

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Real Time PCR
SYBR Green
Sondas
Fluorocromo
Silenciador
Separación Emisión de Fluorescencia
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Real Time PCR

• Ciclo umbral
• Nº de ciclos necesarios para detectar fluorescen
  cia
• Inversamente proporcional a Molde inicial

Fluorescencia
Nº de ciclos
ADN moldei 102 101 100 10-1 10-2
10-3
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Agentes intercalantes

• Ventajas
• optimización de las condiciones de la reacción
  fácil y es más barato que las sondas específicas.
• Inconveniente
• Baja especificidad
• emplear condiciones de reacción óptimas
• Selección cuidadosa de los cebadores para
  disminuir el riesgo de formación de dímeros es
  recomendable iniciar la síntesis de ADN a
  temperaturas elevadas ( h o t-start PCR)
  polimerasas recombinantes modificadas que sólo
  funcionan

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• Cada fragmento amplificado tiene una Tm
  característica, que depende sobre todo de su
  longitud y de la composición de sus bases.
• Esta aplicación permite comprobar, aunque no
  siempre con absoluta garantía, la especificidad
  de los fragmentos detectados en la PCR.

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Sondas de hibridación específica

• Son sondas marcadas con dos tipos de
  fluorocromos, un donador y un aceptor.
• El proceso se basa en la transferencia de energía
  fluorescente mediante resonancia (FRET) entre las
  dos moléculas. Las más utilizadas son las sondas
  de hidrólisis, denominadas también sondas TaqMan,
  las s o n d a s molecular beacons y las sondas
  FRET.

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• Cascade blue (varios)
• Y O Y O-
• B o d i p y f
• fluoresceína (FITC)
• SYBR Green
• T O T O-
• F A M
• L u c i f e r i n a
• T E T
• J O E
• H E X
• C y 3
• P O P O-
• R o d a m i n a

N E D T A M R A Naranja de acridina C y
5 Quantum Red/Red Bromuro de etidio R O
X Red Rojo de Tejas Homodímero de etidio Yoduro
de propidio 7 IRD C y 7 IRD 800
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Sondas de hidrólisis

• Son oligonucleótidos marcados con un fluorocromo
  donador en el extremo 5 que emite fluorescencia
  al ser excitado y un aceptor en el extremo 3 que
  absorbe la fluorescencia liberada por el donador.
  
• Para que esto ocurra, las moléculas donadora y
  aceptora deben estar espacialmente próximas.
  Además, el espectro de emisión de la primera se
  ha de solapar con el espectro de absorción de la
  segunda.

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• Mientras la sonda está intacta, la fluorescencia
  emitida por el donador es absorbida por el
  aceptor. Sin embargo, durante la amplificación,
  la sonda se hibrida con su cadena complementaria.
• Al desplazarse a lo largo de la cadena, la ADN
  polimerasa hidroliza el extremo libre 5 de la
  sonda, produciéndose la liberación del
  fluorocromo donador.
• Como donador y aceptor están, ahora,
  espacialmente alejados, la fluorescencia emitida
  por el primero es captada por el lector.

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(No Transcript)
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Indicadores moleculares

• Son sondas parecidas a las anteriores. Tienen una
  molécula donadora en el extremo 5 y una aceptora
  en el extremo 3, además, presentan una
  estructura secundaria en forma de loop, en la que
  reside la secuencia de unión específica con el
  ADN diana. Los extremos permanecen plegados
  cuando la sonda no está hibridada, lo que
  conlleva que donador y aceptor estén muy cerca
  uno de otro.
• En esta conformación la fluorescencia emitida por
  el donador es absorbida por el aceptor y no es
  captada por el lector del equipo. Sin embargo, al
  hibridar con el ADN diana la sonda se abre,
  alejándose donador y aceptor, pudiendo ser
  detectada la fluorescencia emitida por el
  primero.

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(No Transcript)
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Identificación polifásica de microorganismos

• Técnicas de MALDI-TOF MS
• LC MS/MS

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• La tecnología MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser
  Desorption Ionization-Time of Flight Mass
  Spectrometry) incorporada recientemente en el
  laboratorio de microbiología ha demostrando ser
  un método rápido y preciso para la identificación
  bacteriana. 
• MALDI-TOF identificó adecuadamente a 95,7 de los
  aislados aeróbi-cos y 86,4 de los anaeróbicos
  estrictos, observándose el mayor porcentajes de
  identificación a nivel de especie en los grupos
  de enterobacterias yBacteroides spp (95 y 100
  respectivamente).
• La tasa de error de MALDI-TOF y métodos
  convencionales vs secuenciación fue de 0,39 y
  9,4, respectivamente.
• El costo asociado por identificación fue ocho
  veces menor que el de los métodos tradicionales
  con una demora promedio de seis horas en la
  entrega de resultados.Conclusión MALDI-TOF
  mostró ser una tecnología simple, precisa y de
  menor costo que los métodos tradicionales.

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• Permite la identificación de microorganismos
  mediante el análisis de proteínas, principalmente
  ribosomales, a partir de colonias o directamente
  de muestras a través de la creación de un
  espectro de masas el que es específico para cada
  especie

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Diseño de oligonucléotidos

• En el TP Nº1 (PCR) se encuentran las
  consideraciones más importantes a tener en cuenta
  para el diseño de primers.
• Aprenderemos a cómo diseñar los oligonucleótidos
• Detectar el gen de la enzima Superóxido Dismutasa
  de Niquel (SodN) en la cepa Streptomyces sp. BM

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Búsqueda en base de datos de secuencias de la
SodN.

• http//www.ncbi.nlm.nih.gov/
• En la pestaña All databases seleccionar
  Nucleotide (se conoce la secuencia del gen SodN)
• En la pestaña Search escribir Ni-containing
  superoxide dismutase. Presionar Search

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Seleccionar la 4º opción de la lista (para este
caso es apropiado, porque sabemos que corresponde
a la enzima que estamos buscando).
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Buscar en la página SodN
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Seleccionar gene
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Copiar la secuencia resaltada y pegarla en un
archivo de texto.

• gtSodN
• Atgctttcccgcctgtttgcccccaaggtcacggtcagcgcccactgcga
  cctgccctgcggcgtgtacgaccctgcccaggcccgcatcgaggcggagt
  cggtgaaggccgtccaggagaagatggccggcaacgacgacccgcacttc
  cagacgcgcgccacggtcatcaaggagcagcgcgccgagctcgcgaagca
  ccacgtctccgtgctgtggagcgactacttcaagcccccgcacttcgaga
  agtacccggagctgcaccagctggtcaacgacaccctgaaggccctgtcg
  gccgccaagggctcgaaggacccggcgaccggccagaaggccctggacta
  catcgcccagatcgacaagatcttctgggagaccaagaaggcctga

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(No Transcript)
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Seleccionar BLAST y pegar la secuencia. Correr el
BLAST
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Seleccionar y copiar las secuencias de ADN de

• Streptomyces avermitilis MA-4680
• Streptomyces acidiscabies strain E13
• Streptomyces flavogriseus ATCC 33331
• Streptomyces peucetius ATCC 27952

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-Abrir el programa DNAMAN y cargar todas las
secuenciasRealizar el alineamiento de las 5
secuencias. -Seleccionar el ícono alineamiento y
luego presionar Channel y seleccionar las 5
secuencias.
-Analizar el alineamiento
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-Copiar la secuencia consenso y pegarla en el
canal 6-Ir a Primer/Design PCR Primers for DNA y
seguir los pasos indicados en las pantallas
siguientes
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(No Transcript)
41
(No Transcript)
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• Evaluar las características de los pares de
  primers generados por el programa.
• Copiar la secuencia del primer cebador, ir a
  Primer/Load primer/ From input y pegar la
  secuencia.
• Ir a Primer/Self complementary. Analizar.
• Ir a Primer/Two primer complentarity/Second
  primer from input y pegar el segundo primer.
  Analizar.
• Para este primer repetir el punto b
• Repetir para todos los pares de primers
  obtenidos.
• Seleccionar el par de primer más adecuado.

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PCR in silico. Para ello, debes ingresar en
http//insilico.ehu.es/PCR/De la lista de
genomas que se te despliega debes elegir
Bacillus y luego ingresas a una página donde
debes pegar la secuencia de los primers que
diseñaste anteriormente.
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Oprimir aplified
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Bases de datos en Bioinformática
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Contenidos

1. La bioinformática y las bases de datos
2. Las bases de datos en biología molecular
3. Formato de la información almacenada

Introducción a la Bioinformática
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Información en la era genómica

• El proyecto genoma humano y similares genera un
  inmenso flujo de información
• Para poder utilizar esta información, ha de estar
  almacenada correctamente
• El acceso a la información almacenada ...
• Ha de ser rápido
• Debe poder hacerse de manera flexible
• Esto es posible gracias a la creación de bases de
  datos y distribución vía Internet.

Introducción a la Bioinformática
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48
Para que se utilizan las bases de datos ?

• Búsqueda de información.
• Por palabra clave, números de acceso, autores...
• Búsqueda de homologías
• Hay secuencias igual o parecidas a la mía ?
• Búsqueda de patrones
• Mi secuencia contienen patrones conocidos?
• Predicciones
• Puedo encontrar proteínas parecidas a la mía,
  pero con función conocida?

Introducción a la Bioinformática
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Aspectos a tener en cuenta

• Los proveedores de recursos
• Centros o organizaciones especializadas en tener
  y mantener las bases de datos.
• Bases de datos
• Hay mucha variedad y contiene información diversa
• Las herramientas
• Para encontrar información en las BD
• Para contrastar secuencias contra las BD
• Para exportar la información

Introducción a la Bioinformática
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50
MUCHAS GRACIAS