Diapositive 1

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Protéomique dinteraction
2
(No Transcript)
3
Plusieurs technologies
4
La protéine GAL4
La protéine GAL4 est constituée de deux
domaines   un domaine N-terminal qui lie
spécifiquement une séquence d'ADN (UASG pour
upstream activated sequence for the yeast Gal
genes). un domaine C-terminal contenant une
région acide. Les charges négatives participent à
l'activation transcriptionnelle. Quand le
facteur de transcription GAL4 se lie, il active
la transcription du gène reporter.
5
Le gène reporteur. Le gène reporteur le plus
utilisé est le gène lacZ, qui code pour une
enzyme, la b-galactosidase. L'expression de lacZ
peut-être mesurée par un colorimètre, selon le
test de l'a complémentation des levures basée sur
l'activité de la b-galactosidase.
6
(No Transcript)
7
Copurification de protéines
8
6His
DETECTION
ETIQUETTE
9
(No Transcript)
10
Transfert dénergie de fluorescence par résonance
Expression non toxique dans la levure
11
6His
GFP S65T Biais de codon optimisé pour la levure
Calmodulin binding peptide
Site de coupure pour la protease du TEV Tobacco
Etch Virus
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Obtention dune souche exprimant la protéine de
fusion
Phase de diagnostic
Phase de purification
Phase didentification
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Obtention dune souche exprimant la protéine de
fusion
Fragment PCR
cotransformation
Recombinaison homologue stricte
Vecteur digéré
Rq les  accidents  de PCR (non sens et
frameshift) sont contrôlés par la fluorescence
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(No Transcript)
15
Obtention dune souche exprimant la protéine de
fusion
Phase de diagnostic
16
(No Transcript)
17
(No Transcript)
18
En KDa
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Obtention dune souche exprimant la protéine de
fusion
Phase de diagnostic
Phase de purification
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Obtention dune souche exprimant la protéine de
fusion
Phase de diagnostic
Phase de purification
Phase didentification
21
(No Transcript)
22
(No Transcript)
23
(No Transcript)
24
GENES COMPLEXES
MAK10 MAK3
MAK3 MAK 3, MAK10, MAK 31
MAK31 pas de complexe mis en évidence
STO1 STO1, YKL214C, SNU56, SRO9, BUR2, YDL175C, PRP40, PRP42,HTA1, MSH4, NAB3
MUD13 pas de complexe mis en évidence
TCP1 pas de complexe mis en évidence
TFC1 pas de complexe mis en évidence
ADE4 ADE4 (tétramères)
RVS167 RVS161, YPL249C
RGD1 pas de complexe mis en évidence
YNL300W pas de complexe mis en évidence
YER007C-A TFA1, ASC1, YER007C-A
YKR046C pas de complexe mis en évidence
YCR102C pas de complexe mis en évidence
YFR044C pas de complexe mis en évidence
YFR006W dimères
YGL099W pas de complexe mis en évidence
YGR245C pas de complexe mis en évidence
YDL148C pas de complexe mis en évidence
YNL132W pas de complexe mis en évidence
MAK31 Cellzome
11 protéines / 34 protéines Cellzome
7 protéines Cellzome
Avantage GFP
26 protéines MDS Proteomics
Avantage GFP
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GENES COMPLEXES
RPN9 pas de complexe mis en évidence
PYC1 hétérodimère avec PYC2
TKL1 homodimères
MIP1 pas de complexe mis en évidence
PDA1 TIF2, PFK2, PFK1, LAT1
ENO1 SSC1, ENO1
LPD1 TKL1
PFK1 PFK1, PFK2
TPI1 homodimères
TRP1 pas de complexe mis en évidence
SUR2 pas de complexe mis en évidence
SUP35 SUP35, ROM2, SUP45, TAO3, YJL017W, MRPL23, CLU1, ECM29, NAB3
CDC34 pas de complexe mis en évidence
CDC4 SKP1
CDC53 PDC6, PTC1, PRB1, THI21, YBR280C, SKP1
GRR1 pas de complexe mis en évidence
HRT1 pas de complexe mis en évidence
KEX2 pas de complexe mis en évidence
MET30 MET31, HRT1, MET4, CDC53
SGT2 pas de complexe mis en évidence
PDC6, PTC1, PRB1, POR1, YLR352W, THI21, YBR280C,
SKP1, PDC5 MDS Proteomics
26
GENES COMPLEXES
SKP1 YDR131C, CDC4, SGT1, PRB1, UFO1, CDC53, BOP2
RAD1 pas de complexe mis en évidence
RAD10 TIF2, RNR2, CPH1, ARC1, FUM1, SOD2
RAD14 CTF4, RAD16, RAD4
RAD16 HTB2, RAD7, SHP1, TDH3, VPS1,PDC1, PEP4
RAD17 pas de complexe mis en évidence
RAD18 pas de complexe mis en évidence
RAD2 PEX15
RAD23 pas de complexe mis en évidence
RAD24 YLR413W, TCP1, DUN1,RFC3, RPT3, RFC5, YJR072C
RAD26 pas de complexe mis en évidence
RAD27 POL30
RAD28 TCP1, CCT6, DUN1
RAD3 pas de complexe mis en évidence
RAD30 GPH1
RAD4 pas de complexe mis en évidence
RAD5 pas de complexe mis en évidence
RAD50 SEC27, MRE11
RAD51 MLH1, CLU1, GCN20, GFA1, YHB1,RAD51
RAD52 ALD5
YDR131C, CDC4, SGT1, PRB1, UFO1, CDC53, BOP2 MDS
Proteomics
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GENES COMPLEXES
RAD53 SWI4, ASF1,YMR135C, SMC3, TBF1, SRP1
RAD54 MGE1
RAD55 PTC3
RAD57 pas de complexe mis en évidence
RAD59 SEC27
RAD6 UBA1
RAD7 pas de complexe mis en évidence
RAD9 DUN1
BDF2 BDF1
CBK1 pas de complexe mis en évidence
CDC15 TFP1, AUT2
DUN1 HOM2, SOD1, ADH4, CPH1, PDX3
ESR1 pas de complexe mis en évidence
FZF1 pas de complexe mis en évidence
GDI1 pas de complexe mis en évidence
GUT1 pas de complexe mis en évidence
IRA2 pas de complexe mis en évidence
MLH1 YOR155C, MGE1, SGS1, HDA1, MGM101, RFA2, , TOP3, VAS1, RNH1
MSH2 RSC8,LCD1, MSH6, PLO1, PLO2, RNH1,
MSH6 SGS1, MEC1, RSC8,PLO1, PLO2, TOP3, VAS1
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GENES COMPLEXES
NCR1 pas de complexe mis en évidence
PMA1 pas de complexe mis en évidence
SCH9 pas de complexe mis en évidence
SET1 BRE2
SGS1 pas de complexe mis en évidence
SOD1 pas de complexe mis en évidence
SSL1 TFB3, TFB4, SPT7 CCL1, SSL1, CDC95, MRPS28, KAP95, TFA1, TFB1
SSL2 STI1
TEL1 YPL110C
YDL085W pas de complexe mis en évidence
YMR145C pas de complexe mis en évidence
YPK1 pas de complexe mis en évidence
BAS1 pas de complexe mis en évidence
GRF10 pas de complexe mis en évidence
YOR155C pas de complexe mis en évidence
BOI1 pas de complexe mis en évidence
BOI2 pas de complexe mis en évidence
SRA1 pas de complexe mis en évidence
CYR1 PHO81, ACT1, SRV2
LAS17 RPN12, END3, YCR030C, SLA2, VMA1, VRP1, SLA1
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Au moins 5 méthodes de copurification
Système TAP Tag (Cellzome)
Système Flag Tag (MDS Proteomics)
Système HisMyc Tag (John Yates)
Système CHH Tag (CSHL)
Système GFP TAP Tag (Bordeaux)
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Cellzome
Fonctional organization of the yeast proteome by
systematic analysis of protein complexes. Gavin
et al
10 janvier 2002
MDS Proteomics
Systematic identification of protein complexes in
Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Ho
et al
14182 interactions protéine-protéine (299)
Laddition systématique dune étiquette à une
protéine appât constitue une limite pour les
approches globales
31
(No Transcript)
32
Séparation directe des complexes
Séparation par chromatographie bidimensionnelle
des complexes protéiques stabilisés par un agent
pontant
Purification et identification des peptides
impliqués dans les complexes protéiques
33
Après la lyse des cellules les protéines sont
récupérées
34
Puis les complexes protéiques sont stabilisés en
utilisant un agent pontant (dithiosuccinimidylprop
ionate)
35
DSP (mM)
0
0.5
1
1.5
2
4
6
8
Solubilisation sans mercaptoéthanol
36
Les complexes protéiques stabilisés sont séparés
selon leur charge en utilisant un Rotofor
37
Ampholines pH 3,5-10
20 3 20 37 fractions
Sans Ampholines
38
Chaque fractions issues du Rotofor sont séparées
selon la taille par chromatographie dexclusion
(Superdex200)
37 chromatographies
1850 fractions
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MALDI - TOF
Données
MALDI - TOF
Données
MALDI - TOF
LC/MS/MS
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Séparation directe des complexes
Séparation par chromatographie bidimensionnelle
des complexes protéiques stabilisés par un agent
pontant
Purification et identification des peptides
impliqués dans les complexes protéiques
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Après la lyse des cellules les protéines sont
récupérées
42
Biotine
Groupes réactifs capables de se fixer aux NH2
43
Biotine
Groupes réactifs capables de se fixer aux NH2
Congrès ASMS 2001 Michelle Trester-Zedlitz et al
Faisabilité sur un complexe
44
Biotine
Groupes réactifs capables de se fixer aux NH2
45
Protéolyse spécifique des protéines
46
Purification par affinité des peptides (avidine
sépharose)
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Identification des peptides associés
Analyse par spectrométrie de masse (LC/MS/MS)
Même protéine
Protéines différentes
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3 méthodologies
Copurification de protéines étiquetées (proposé
en service et en développement Helicobacter
pilori)
Séparation des complexes stabilisés par
chromatographie liquide bidimensionnelle
Purification et identification des peptides
impliqués dans les complexes protéiques (stade du
développement de la molécule)
49
ProteinChips
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)