Methoden zur Sequenzierung von DNA

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Methoden zur Sequenzierung von DNA

• Anne Röschenkemper
• SS 2006

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Was ist DNA-Sequenzierung?

• Die Analyse der DNA-Struktur auf Nucleotid-Ebene
• Erst seit 1977 gibt es DNA-Sequenzierungstechniken
  
• Gründe dafür
• Erst seit dieser Zeit gibt es Klonierungstechniken
  , durch die DNA in ausreichender Menge erhalten
  werden kann
• Auch Restriktionsendonucleasen kennt man erst
  seit Mitte der 70er Jahre nur durch Behandlung
  mit diesen Enzymen kann DNA in kleine Fragmente
  zerteilt werden ( auch rekonstruiert werden)

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Welche Methoden gibt es?

• Sequenzierung durch chemische Spaltung ? Die
  Maxam-Gilbert-Methode
• Sequenzierung durch Kettenabbruch ? Die
  Sanger-Methode
• weitere Methoden zB.
• ?Pyrosequenzierung
• ? Sequenzierung durch Hybridisierung

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Sequenzierungsstrategien

• Problem nur ca. 1000 bp können mit dem
  Sanger-Verfahren sequenziert werden
• Lösung
• Spezifischer Abbau und Fraktionierung durch
  Restriktionsendonucleasen ? kleine, vollständig
  sequenzierbare Fragmente
• Sequenzierung
• Rekonstruktion der Fragmente (durch overlap)

Komplette Sequenz
RE 1
RE 2
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Sequenzierung durch chemische SpaltungDie
Maxam-Gilbert-Methode

• Von Allan Maxam und Walter Gilbert entwickelt
  erste Veröffentlichung Februar 1977 (PNAS)
• Prinzip basenspezifische Spaltung
• ?spezifische Spaltung an einem einzigen
  Nucleotid-Typ durch bestimmte Reagenzien
• ?Jedes DNA-Fragment wird im Durchschnitt nur
  einmal gespalten (zufällig an einer der chemisch
  sensiblen Bindungen)
• ?radioaktive Markierung des 5 - Endes mit 32P

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Die Maxam-Gilbert-Methode

• Markierung des 5-Endes mit 32P

Wenn schon P an 5 vorhanden Im zweiten Schritt wird nun radioaktiv markiertes ATP benötigt (am ?-Phosphor-Atom)
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Die Maxam-Gilbert-Methode

• Beispiel für eine basenspezifische Spaltung
• 32P- A T G T A G G T C A G A -3- T
• ?Spaltung an der 5-Seite von G
• 32P- A T G T A G G T C A
• 32P- A T G T A G
• 32P- A T G T A
• 32P- A T
• Die 5-markierten Fragmente können nun
• detektiert werden

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Die Maxam-Gilbert-Methode

• Detektion der 5-markierten Fragmente
• mittels PAGE ? Trennung nach Größe
• Autoradiogramm

A T G C
Leserichtung
Laufrichtung
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Die Maxam-Gilbert-Methode

• Spezifische Spaltung an G
• Reagenzien
• ? Dimethylsulfat
• ? Piperidin

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Die Maxam-Gilbert-Methode

• Spezifische Spaltung an A G
• ähnlich der G-Spaltung
• Reagenzien ? Dimethylsulfat
• ? Piperidin
• Methylierung von A an N(3) und nicht an N(7)
• Reaktion unter sauren Bedingungen (Spaltung von A
  unter basischen Bedingungen 5 mal langsamer als
  G-Spaltung) ?A G werden in gleichen Anteilen
  gespalten
• Ermittlung der A-Positionen durch Vergleich von
  G und GA

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Die Maxam-Gilbert-Methode

• Spezifische Spaltung an C T
• Reagenzien ? Hydrazin
• ? Piperidin

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Die Maxam-Gilbert-Methode

• Spezifische Spaltung an C
• Ähnlich der CT-Spaltung
• Reagenzien ? Hydrazin
• ? Piperidin
• Zusätzlich Lösung enthält NaCl
• Dadurch findet die Spaltung fast nur an C statt
• Ermittlung der T-Positionen durch Vergleich von
  C und TC

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Die Maxam-Gilbert-Methode

• Vorteile
• Eine Sequenz kann allein mithilfe der
  Restriktionskarte entschlüsselt werden
• Die Sequenz kann fast vollständig ermittelt
  werden
• Die Sequenz kann vom ursprünglichen DNA-Molekül
  stammen (nicht von einer enzymatisch
  hergestellten Kopie) ? keine Kopierfehler
• Nachteile
• Nur relativ kurze Sequenzen können ermittelt
  werden
• Relativ langsame und unzuverlässige Methode (im
  Vergleich zur Sanger-Methode)
• Gefährliche Chemikalien werden verwendet

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Sequenzierung durch KettenabbruchDie
Sanger-Methode

• Nach Frederick Sanger (et al.) erste
  Veröffentlichung Dezember 1977
• Prinzip in-vitro-Synthetisierung mit
  Kettenabbruch
• Zu einem denaturiertem DNA-Strang wird mithilfe
  von DNA-Polymerase ein komplementärer Strang
  synthetisiert
• Die Reaktion wird an einer bestimmten Base
  gestoppt, indem ein Didesoxynucleotid in den
  Strang eingebaut wird
• Detektion per Autoradiographie oder Fluorimetrie

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Die Sanger-Methode

• Didesoxynucleotide
• ? die DNA wird in 3-5-Richtung verlängert
• ? der ddNTP fehlt in der 3-Position die
  OH-Funktion, an der ein weiteres Nucleotid
  andocken könnte
• ? wird ein ddNTP in den Strang eingebaut, stoppt
  die Synthese
• ? um genügend lange Sequenzen zu erfassen, darf
  der ddNTP -Anteil nur gering sein ( 1200 ddNTP
  dNTP)
• ? man macht vier Ansätze ddATP, ddGTP ,ddCTP,
  ddTTP

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Die Sanger-Methode

• Benötigte Komponenten
• DNA-Einzelstrang
• Primer
• DNA-Polymerase
• dNTPs
• ddNtp (pro Ansatz nur eine Sorte)
• Markierung
• Elektrophoresesystem

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Die Sanger-Methode

• Die Kettenabbruchmethode im Überblick

vier Ansätze
zufällige Verteilung der ddNTPs
Nur die synthetisierten Stränge werden erfasst
Prinzip kleine Moleküle wandern schneller!
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Die Sanger-Methode

• Fluoreszenzsequenzierung

• Man kann Primer, ddNTPs oder dNTPs kovalent an
  Fluorophore knüpfen ? wenn man pro
  Reaktionsansatz ein anderes Fluorophor verwendet,
  benötigt man nur eine Gelelektrophorese-Laufspur
• Vorteil
• ?schneller als Autoradiographie
• ?Ungefährliche Substanzen
• ?leicht automatisierbar (10.000 Basen können pro
  Tag identifiziert werden manuelle Methode 150
  / d)

?
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Die Sanger-Methode

• Zyklische Sequenzierung I
• Problem der Standardkettenabbruchmethode
• Empfindlichkeit der Methode wird durch die
  Molarität der
• DNA-Sequenz begrenzt
• Lösung
• zyklische Sequenzierung

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Die Sanger-Methode

• Zyklische Sequenzierung II
• Vorteile
• wenig DNA wird benötigt
• hohe T verhindert Sequenzartefakte
• leicht automatisierbar
• Nachteile
• Taq-Polymerase baut Fluoreszenz-ddNTPs recht
  schlecht ein
• Taq.Polymerase liest hochpolymere Basenfolgen
  schlechter

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Die Sanger-Methode

• Vorteile
• Man kann längere Sequenzen als mit dem
  Maxam-Gilbert-Verfahren sequenzieren
• Schnelle recht zuverlässige Methode leicht
  automatisierbar
• Man kann radioaktive Reagenzien mit der
  Fluorimetrie umgehen
• Nachteile
• Man benötigt einen Primer
• ?ein Teil der Sequenz muss bekannt sein

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Fazit

• Die Sanger-Methode ist besser als die
  Maxam-Gilbert-Methode!!!

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Alternative Methoden

• Sequenzierung durch Hybridisierung
• Pyrosequenzierung
• Mikrokanal-Sequenzierung
• Massenspektrometrie
• Rastertunnelmikroskopie
• Nanoporen

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Alternative MethodenSequenzierung durch
Hybridisierung

• gelfreie Sequenzierungsmethode ? micro arrays
• Matrize von kurzen Oligonucleotiden, die sich auf
  einer Glas- oder Siliciumoberfläche befinden
• die zu sequenzierenden DNA-Fragmente werden
  markiert und auf die Oligonucleotidmatrix
  gebracht, so dass komplementäre Strukturen
  hybridisieren
• aus den Hybridisierungsmustern (Position und
  Signalintensität) kann auf die Sequenz
  geschlossen werden
• Probleme ? Fehlhybridisierungen
• ? repetitive Sequenzen sind
  schwer zu analysieren
• Aber
• kürzere Sequenzabschnitte oder Mutationen können
  mit dieser Methode erkannt werden
• ? Medizinische Diagnostik (z.B. SNPs)

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Alternative MethodenSequenzierung durch
Synthetisierung Pyrosequenzierung I

• Methode ohne Gele und Marker
• Prinzip Beobachten der Synthese
• zu der einzelsträngigen DNA werden Enzyme gegeben
  und dann abwechselnd die verschiedenen Nucleotide
• man benötigt vier Enzyme
• DNA-Polymerase ? Einbau der Nucleotide
• Apyrase ? Abbau ungenutzter Nucleotide
• Sulfurylase ? Erzeugung von Licht aus PPi
• Luciferase ?

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Alternative MethodenPyrosequenzierung II

• die Lichtemission wird aufgezeichnet und ist in
  einem Pyrogramm als Peak erkennbar
• die Intensität des Lichts ist proportional zur
  Anzahl der in den Strang eingebauten Basen
• schnelle Methode
• ideal für die medizinische Diagnostik

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Bedeutung der DNA-Sequenzierung

• Das Humangenomprojekt
• Sequenzierung der menschlichen DNA (3,2 Mrd.
  bp!!!)
• Erkennung von codierenden Sequenzen (30.000
  40.000 Gene) für z.B.
• monogene Krankheiten wie Alzheimer, Brustkrebs,
  Diabetes (jeweils die vererbbaren Formen)
• Enzymmutationen und damit verbundene
  Medikamentenunverträglichkeiten (z.B.
  CYP-450-Enzyme)

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Bedeutung der DNA-Sequenzierung

• DNA-Chips für CYP-450
• bestimmte Enzyme dieser Familie sind an der
  Metabolisierung von Arzneimitteln beteiligt
• Fehlerhafte Gene führen zu veränderter
  Metabolisierung z.B. das CYP-2D6-Gen
• Variante A normale Aktivität
• Variante B verstärkte Aktivität (ultraschneller
  Metabolisierer)
• Variante C inaktives Enzym (langsamer
  Metabolisierer)
• bei Prodrugs B ? toxische Effekte
• C ? keine Effekte
• (z.B. wird Codein durch dieses Enzym zu Morphin
  metabolisiert)
• Lösung für diese Probleme
• DNA-Chip, der fehlerhafte Varianten des Gens
  erkennt und dadurch
• eine verbesserte Therapie ermöglicht

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Bedeutung der DNA-Sequenzierung

• Ausblick
• durch die Verwendung von DNA-Chips in der
  medizinischen Diagnostik können SNPs und andere
  genetische Veränderungen erkannt werden
• dies macht eine auf den zugeschnittene
  Therapie, die nicht nur äußere Faktoren wie
  Gewicht und Geschlecht berücksichtigt, möglich
• Möglichkeit der Früherkennung genetisch bedingter
  Krankheiten
• Methoden wie die von Sanger eignen sich eher zur
  Sequenzierung des kompletten Genoms, sind für die
  medizinische Diagnostik meist zu langsam und
  kompliziert, dafür aber genauer

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Literatur

• Voet, Voet Biochemie
• Luke Alphey DNA-Sequenzierung, 1998 Spektrum
  Akademischer Verlag
• Müller-Esterl Biochemie, 2004 Elsevier Verlag
• Lottspeich, Zorbas Bioanalytik, 1998 Spektrum
  Akademischer Verlag
• www.pyrosequencing.com
• Die Humangenomforschung in Deutschland BMBF
• Sanger et al. DNA-Sequencing with
  chain-terminating inhibitors Proc. Natl. Acad.
  Sci. USA, Vol. 74 (1977), pp. 5463-5467
• Maxam, Gilbert A new method for Sequencing
  DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 74 (1977),
  pp. 560-564