Molekulare Zellbiologie

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Molekulare Zellbiologie

• Molekularbiologische Methode
• I. DNA

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DNA-Struktur

• Primärstruktur
• Sequenz der Nucleotiden, lineare Polymer,
• Phosphodiestherbindungen
• Sekundärstruktur
• Doppelhelix, H-Brücken
• Tertiärstruktur
• Superhelix
• Quarternärstruktur
• DNP, Chromatin

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• Sekundärstruktur
• Die Faltung der Makromolekül
• Nichtkovalente Bindungen
• DNA
• Doppelhelix
• stabilisiert durch H-Brücken

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Hybridiesierung

• In vivo
• Enzymatisch
• (DNA-Replikation, Transcription)
• In vitro
• Wärme (PCR)
• alkalische Lösungen (Southern-blot)
• Formamid und Harnstoff (Sequenzierung)

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• Denaturierung
• Sekundär- (Tertiär, Quaternär-) struktur
• nichtkovalente-Verbindungen
• Hydrolyse
• Primärstruktur
• kovalente Verbindungen

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UV-Absorption der DNA

• Absorptionsmaximum 260 nm
• Konzentrationsbestimmung
• Bei Denaturierung steigt der UV-Absorption

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Schmelztemperatur -Tm

• diejenige Temperatur, bei der sich 50 der
  DNA-Stränge trennen
• steigt mit zunehmenden G/C-Gehalt der DNA (3
  H-Brücken)

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Molekularbiologische Methoden

• Restriktionsendonucleasen
• Cloning
• Molecular hybridisation
• Southern blot
• Sequencing
• PCR
• Genom library

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Filter-Hybridisierung

• Denaturierung
• Filterbindung
• Hybridiesierung mit der Probe (radioaktive)
• Waschen
• Radiokativität messen
• Fragen
• Anwesenheit der komplementäre Strang
• Quantität der komplementären DNA/RNA

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In situ Hybridisierung

• Mikroskopisches Preparat
• Denaturierung
• Hybridiesierung mit der Probe (fluorescent)
• Waschen
• Fluorescent Mikroskop (Lichtmikroskop)
• Fragen
• Anwesenheit des komplementären Stranges
• Wo?

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Die Restriktionsendonuclease

• Nuclease schneidet Phosphodiesterbindungen in
  Nucleinsäure
• Endo/Exo Nuclease
• Restriktion Erkennungstellen bzw. Bakterielle
  Restriktion-Modifikations-System

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Die Restriktionsendonuclease

• dsDNA-specifische Endonuclease, mit einer
  specifischen Erkennungssequenz
• Palindrom
• adhäsive oder glatte Ende

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Restriktionskarten

• Verdau mit RE
• Agarose Gelelectrophorese
• Wanderung zur positiven Electrode
• Größere Fragmente wandern langsamer
• Fluoreszierende Farbstoff die an DNA bindet
• Relative Lagerung der RE-Erkennungsequenzen kann
  determiniert werden.

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In Vitro DNA-Synthese

• DNA-Polymerase
• DNA-Matrize
• Primer
• 4 dNTPS , ein radioaktiv markiert
• Puffer
• Separierung der freien Nucleotiden von
  DNA-Strangen

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Enzymatische DNA-Sequenzierung

• In vitro DNA-Synthese
• Primer (oder dNTP) radioaktiv markiert
• ddNTP (die 3-OH-Gruppe fählt)
• 4 in vitro Reaktionen mit 4 verschiedenen ddNTPs
  (110)
• Denaturierende Electrophorese (PAGE mit Harnstoff
  und Formamide)
• Autoradiographie

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Polymerasekettenreaktion (PCR)

• In vitro DNA-Synthese
• Hitzestabile DNA-Polymerase
• Primer-Paar
• Zyklen
• 1. Denaturierung (95 C)
• 2. Primer-Bindung (60 C)
• 3. Primer-Verlängerung (60-70 C)
• Gelelectrophorese

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PCR

• Existenz einer Sequenz in der DNA-Mischung
• Klonierung (Amplifizierung)
• Länge der DNA-Fragment -Mutationsanalyse