CDKs%20y%20Ciclinas

1
CDKs y Ciclinas

• Y. Acosta, N. Akizu, E. Castellanos, A.
  Corrionero y M. Ruiz

2
CDKs y ciclinas
Introducción

• CDKs (Cyclin-Dependent Kinases)
• Ser/Thr Kinasas
• Fosforilación de histonas, proteínas
• del citoesqueleto, APC, pRB...
• 33-40 kDa
• CDK1-4 y CDK6
• Regulación
• Ciclinas
• Fosforilación
• Inhibidores (CKIs)

REGULACIÓN
CICLO CELULAR
3
Introducción

• Ciclinas
• Reguladoras actividad de CDK
• Concentraciones variables a lo largo del ciclo
• Ciclinas A, B, D, E
• Degradadas por ubiquitinación

4
Ciclo celular
Introducción

• Se divide en 4 fases
• Fase G1 preparación para la duplicación del DNA
  aumento del tamaño y síntesis de proteínas.
• Fase S se produce la duplicación del DNA.
• Fase G2 comprobación de la correcta replicación
  del DNA.
• Fase M condensación del DNA en cromosomas y
  separación de las cromátidas dando lugar a los
  dos núcleos de las células hijas. Citocinesis.

5
Ciclo celular
FASE COMPLEJO
G1 Cdk4,6/ciclinaD Cdk2/ciclinaE
S Cdk2/ciclinaA
G2/M Cdk1/ciclinaB
M Cdk1/ciclinaB
6
CDKs
7
Clasificación
CDKs

• Clase a ß
• Plegamiento Protein Kinase-like
• Superfamilia Protein Kinase-like
• Familia Protein Kinase, catalytic subunit
• Subfamilia Serine/Threonin Kinases

8
CDKs
Regulación
CDK
Inactiva
INK4 Inhibidores
Ciclina
CDK-Ciclina
Parcialmente activa
Cip Inhibidores
CAK
Fosforilación inhibitoria
Ciclina-CDK- P
Totalmente activa
9
Estructura
CDKs

• Región N-terminal (N-lobe) láminas ß
• PSTAIRE
• Región C-terminal (C-lobe) hélices a
• Región central
• Centro catalítico
• Unión ATP
• T-loop

10
CDK2
N-lobe
N-lobe
PSTAIRE
PSTAIRE
90º
T-loop
T-loop
C-lobe
C-lobe
11
CDKs
CDK2-CDK6
PSTAIRE
N-lobe
Thr160
PSTAIRE
T-loop
Thr160
Thr153
Thr153
T-loop
CDK2 CDK6
C-lobe
RMSD 1.25
12
RMSD 1.25
13
CDKs
CDK2-CiclinaA
CDK2 T-loop PSTAIRE Ciclina A
Sustrato ATP Mg
14
Ciclinas
15
Ciclinas
Clasificación

• Clase All a-proteins
• Plegamiento Cyclin-like
• Superfamilia Cyclin-like
• Familia Cyclin

16
Estructura
Ciclinas

• 12 hélices a en dos dominios (90 aa) con idéntico
  plegamiento
• Caja ciclina (hélices a1- a5)
• hélice a3 núcleo hidrofóbico
• Hélices a1- a5
• Caja de ubiquitinación (9 aa en
  N-terminal)

Right handed 3 helix bundle
2 a hélices
17
(No Transcript)
18
Ciclinas
Superposición de dominios 3 helix-bundle 2
hélices a
a5
a3
a4
a2
a1
RMSD 2.50
19
CDKs
CiclinaA-CiclinaH
RMSD 2.50
20
CDKs
CiclinaA-Ciclina Viral
RMSD 2.50
21
CDK2-CiclinaA
22
Superposición CDK2
CDK2 CDK2/CiclinaA CDK2-P/CiclinaA
T-loop
PSTAIRE
RMSD1.49
23
Superposición CDK2
CDK2-CDK2/ciclina
CDK2/ciclinaA CDK2
PSTAIRE
Thr160
T-loop
CDK2/ciclinaA CDK2 (T-loop)
(T-loop)
Thr160
Giro reverso Hélice aL12 Hojas ß
RMSD1.39
24
Superposición CDK2
CDK2/ciclinaA -CDK2-P/ciclinaA
CDK2/CiclinaA
PSTAIRE
T-loop
CDK2-P/CiclinaA
RMSD0.80
25
Interacciones CDK2
26
Interacciones CDK2
Interacciones THR160
Arg50
Arg50
Thr160
Arg150
Arg150
Arg126
Thr160
Arg126
CDK2
CDK2/ciclinaA
27
Interacciones CDK2
Interacciones THR160
CDK2-P/ciclinaA
CDK2/ciclinaA
Arg50
Arg50
Arg150
Arg126
Arg126
Thr160
Thr160
28
Interacciones CDK2
Sustrato y ATP/Mg
PSTAIRE
ATP
Mg
Sustrato
T-loop
29
Interacciones CDK2
ATP/Mg
- CiclinaA
CiclinaA
Lys33
Lys33
ATP
Asp145
Glu51
Glu51
Mg
Asp145
30
Interacciones CDK2
Interacciones sustrato
Lys33
ATP
Glu51
Asp145
Mg
Phe267
Sustrato
Ile270
Arg169
T-loop
31
Interacciones CDK2-CiclinaA
32
Interacciones CDK2-ciclinaA
Interacciones CDK2-CiclinaA
CDK2 T-loop PSTAIRE Ciclina A
Sustrato ATP Mg
33
Interacciones CDK2-ciclinaA
Interacciones CDK2-CiclinaA
34
Interacciones CDK2-ciclinaA
Hidrofóbicas
CDK2 His71 Val69 Leu72 Ile52 Ile49 Leu54
CiclinaA Leu299 Phe304 Leu263 Leu306 Ala307 Phe267

35
Interacciones CDK2-ciclinaA
Puentes de Hidrógeno
CDK2 CiclinaA
T39 K289
E40 K288
V44 E295
V44 K266
E42 K266
S46 K266
R50 F267
S53 D145
K56 D305
E57 Y185
H71 H296
R122 A307
R122 E269
R150 E269
R150 I270
V156 N173
Y180 N173
N272 E174
S276 D177
A277 Y178
K278 D181
K278 Y178
36
Interacciones CDK2-ciclinaA
Van der Waals
37
Interacciones CDK2-ciclinaA
Van der Waals
CDK2 Ile52 Leu54 Ala151 Phe152 Tyr159
CiclinaA Leu299 Phe207 Ala307 Phe267 Ile182 Ile270

38
Conservación de residuos funcionales
39
Conservación de residuos
CDKs
1
Interacción con ciclina Interacción
Thr160 Interacción ATP/Mg PSTAIRE
98
Aa conservados
40
Conservación de residuos
CDKs
99
Interacción con ciclina Interacción
Thr160 Interacción ATP/Mg T-loop
228
Aa conservados
41
Conservación de residuos
Ciclinas
151
Interacción con CDK Interacción
intramolecular Caja ciclina
282
42
Conservación de residuos
Ciclinas
283
Interacción con CDK Interacción
intramolecular Caja ciclina
350
43
Inhibición por p27Cip
44
Inhibición por p27
Inhibidores

• Familia Kip/Cip
• Inhibición de la forma totalmente activa
• Ej p27Cip y p21Cip inhiben CDK2 y CDK4
• Familia INK4
• Inhibición de la unión de ciclina a CDK.
• Inhibición del complejo activo.
• Ej p16INK4a inhibe CDK6
• Proteína Wee
• Inhibición por fosforilación de Thr14-Tyr15 de
  CDK.

45
Inhibición por p27
Interacción con CDK2/ciclinaA
CiclinaA
p27

• Dos mecanismos
• - Cambio conformacional
• - Mimetización ATP

CDK2
46
Inhibición por p27
Cambio conformacional CDK2
CDK2-P/ciclinaA p27 CDK2-P/ciclinaA CDK2/ciclina
A
RMSD0.72
47
Inhibición por p27
Mimetización ATP
p27
ATP
Lys33
Lys33
Glu51
Glu81
Glu81
Tyr88
Glu51
Leu58
Leu83
Leu83
Leu58
48
Ciclina del Herpesvirus murino
49
Ciclina herpesvirus
Ciclinas virales

• ?-herpesvirus
• Relacionado con desórdenes neoplásicos
• Ej HSV, ?-herpesvirus murino...
• Mecanismo presenta homólogos de ciclina (V-, K-
  y M-ciclinas) que forman complejos con CDKs,
  impidiendo su inhibición.
• INDUCCIÓN
• CICLO CELULAR

50
CDKs
CiclinaA-Ciclina Viral
a3
a2
a5
a1
a2
Caja ciclina
a4
Asp220
a1
Glu283
a4
a3
Leu297
a5
Leu255
RMSD2.50
51
Ciclina herpesvirus
CDK2/ciclinaA - CDK2/ciclina viral
CDK2/CiclinaA
CDK2/Ciclina viral
CDK2/Ciclina viral
CDK2/CiclinaA
RMSD1.084
52
Conclusiones
Conclusiones

• Regulación de la actividad de CDKs por cambios
  conformacionales inducidos por unión a ciclina y
  fosforilación.
• Gran flexibilidad alrededor de la hendidura
  catalítica y conservación de residuos
  funcionales.
• Esta flexibilidad puede indicar una respuesta
  evolutiva a la necesidad de regulación ante
  diversas señales.

53
Materiales, Métodos, y Bibliografía.
54
Materiales y métodos
Materiales y métodos
SECUENCIAS y PDBs
PROGRAMAS RasMol v2.5 Hmmer v2.2 Stamp v4.2
Nº iden. CDK Nº iden. Ciclina
NP_0017777 CDK1 NP_001228.1 A hum
PDB 1hcl CDK2 AAH10958.1 D2 hum
NP_001249 CDK3 AAH06510.1 B1 hum
NP_000066 CDK4 P24864 E1 hum
NP_001250 CDK6 AAH49086.1 D2 musc
NP_002721 PKA NP_031659.1 E1 musc
NP_595624 CDC2 NP_031654.1 A1 musc
NP_009718 CDC28 AAH11478.1 B1 musc
PDB ESTRUCTURAS NP_013926.1 Cln1p
1qmz CDK2-P/ciclinaA NP_009360.1 Cln3p
1fin CDK2/ciclinaA CAA98729.1 Clb3
1hcl CDK2 AAB68061.1 Clb5p
1g3n CDK6/ciclina viral/INK28
1jsu CDK2-P/ciclinaA/p27
1f5q CDK2/ciclina viral
55
Bibliografía
Bibliografía

• Papers
• Bártová, I., Otyepka, M., Križ, Z. Koca, J.
  (2003). Cyclin-dependent protein kinase-2
  regulation by phosphorylation, a molecular
  dynamics study. Cell. Mol. Biol. Lett., 8, No2A.
• Card, G. L., Knowles, P., Laman, H., Jones, N.
  McDonald, N. Q. (2000). Crystal struucture of a
  ?-herpesvirus cyclin-cdk complex. EMBO Journal,
  19, 2877-2888.
• Morgan, D. O. (1995). Principles of CDK
  regulation. Nature, 324, 131-134.
• Jeffrey, P. D., Russo, A. A., Polyak, K., Gibbs,
  E., Hurwitz, J., Massague, J. Pavletich, N. P.
  (1995). Mechanism of CDK activation revealed by
  the structure of a cyclinA-CDK2 complex. Nature,
  376, 313-320.
• Liu, J. Kipreos, E. T. (2000). Evolution of
  Cyclin-Dependent Kinase (CDK) and CDK-Activating
  Kinases (CAKs) Differential Conservation of CAKs
  in Yeast and Metazoa. Mol. Biol. Evol, 17(7),
  1061-1074.
• Pavletich, N. P. (1999). Mechanism of
  Cyclin-dependent Kinase Regulation Strucures of
  Cdks, their Cyclin Activators, and Cip and INK4
  Inhibitors. J. Mol. Biol. 287, 821-828.
• Russo, A. A., Jeffrey, P. D., Patten, A. K.,
  Massague, J. Pavletich, N. P. (1996a). Crystal
  structure of the p27Kip1cyclin-dependent-kinase
  inhibitor bound to the cyclinA-CDK2 complex.
  Nature, 382, 325-331.
• Russo, A. A., Jeffrey, P. D., Patten, A. K.
  Pavletich, N. P. (1996b). Structural basis of
  cyclin-dependent kinase activation by
  phosphorylation. Nature Struc. Biol. 3, 696-700.
• Libro
• Branden, C. Tooze, J. Introduction to Protein
  Structure. 2a. ed Garland Publishing, 1998.

56
PREGUNTAS PEM
1.- Por qué mecanismos las ciclinas dependientes
de quinasas (CDKs) se regulan?   a) La unión de
la ciclina a la CDK comporta la total activación
de la molécula de CDK b) Las tres familias de
inhibidores que se conocen actúan inhibiendo la
fosforilación del complejo
CDK-ciclina. c) Las dos anteriores son
ciertas d) La fosforilación de la CDK permite
que ésta pueda actuar fosforilando sus
sustratos e) Todas las anteriores son
falsas        2.- Cuáles de las siguientes
afirmaciones son ciertas?   1. Predominio de
láminas beta en la región N-terminal 2.
Predominio de hélices alfa en la región
C-terminal, entre la que encontramos la hélice
PSTAIRE (zona de unión a la ciclina).
3. En la región central encontramos el punto de
unión a ATP y el T-loop 4. Diferentes estudios
de superposición han demostrado que la región que
más se mantiene en diferentes CDKs es la
hélice PSTAIRE   a) 1, 2 y 3 b) 1 y 3 c) 2 y
4 d) 4 e) 1, 2, 3 y 4
57
3.- Qué plegamiento caracteriza a la caja
ciclina? a) Left handed 4 helix bundle 2
hèlices alpha b)Right handed 7 helix bundle 2
láminas beta c)Right handed 3 helix bundle 2
hèlices alpha d)Left handed 5 helix bundle 3
hèlices alpha e)Cap de les anteriors 4.-
Cuantos dominios tienen las ciclinas? a)2, uno
formado por hélices alfa y otro por láminas
beta. b)5, formando una proteína
transmembrana. c)Un único dominio formado por
láminas beta d)2, ambos formados por hélices
alpha y con idéntico plegamiento e)En realidad
son 2 proteínas que forman la subunidad ciclina.
58
5.- Amb què interacciona la forma totalment
activa de la CDK? a)      Substrat b)    
ATP c)      Les dues anteriors són
correctes d)     Ciclina e)     Totes les
anteriors 6.- Quin nom rep el conjunt dels tres
aminoàcids (Glu51, Lys33 i Asp145) que uniexen
lATP (i el Magnesi)? a)      Clivella
catalítica b)     T-loop c)      Tríada
catalítica d)     Butxaca hidrofòbica e)
Hèlix PSTAIRE
59
7.- Qué residuos se conservan mayoritariamente a
lo largo de la evolución en las proteina
quinasas? a) Los que interaccionan con la
ciclina b) Los que interaccionan con inhibidores
de cdks c) Los que interaccionan con ATP d) Los
que interaccionan con treonina fosforilada e) c)
y d) son verdaderas 8.- Qué región del cdk es
imprescindible en la interacción con la
ciclina? a) La hélice PSTAIRE b) La lámina beta
de la región N terminal c) La lámina beta de la
región C terminal d) El T loop e) La hendidura
catalítica
60
9.- Cuáles son los mecanismos por los que el
p27cip inhibe el complejo cdk-ciclina activo?
a) Mimetizando el ATP y generando un cambio
conformacional b) Mimetizando el sustrato y
generando un cambio conformacional c)
Defosforilando la treonina (cuya fosforilación es
necesaria para la activación total del complejo
cdk-ciclina) d) a) y c) son verdaderas. e)
Todas son falsas. 10.- Cuál es el mecanismo
por el cual la ciclina viral impide la inhibición
de la actividad cdk-ciclina viral? a) Cambio
conformacional en la cdk y sustitución de
residuos de la ciclina viral b) Cambio
conformacional del inhibidor
c) Fosforilación del inhibidor
d) Cambio conformacional de la cdk
e) Fosforilación de la treonina de la cdk