VGLUT1

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VGLUT1 Un transporteur de glutamate localisé
dans les vésicules synaptiques
Lintérêt?
Mécanisme de remplissage inconnu Concentration de
glutamate inconnue Dynamique/mécanisme de
livraison au synapse inconnu
Lacide glutamique (transmission excitatoire)
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Remplissage de Glu par VGLUT1
PC12
Cinétique (3-4 )
Temps (min)
3
Tot
-Liée
lhypothèse homo-dimère
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• Purification

Reconstituer le remplissage des vésicules en
utilisant des vesicules formés in
vitro/lipide-detergent et des composants purifiés?
(Achevée en utilisant une fraction de cerveau de
boeuf avant que la protéine neût été decouverte)


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Génération rapide de vésicules concentrés
l
Colonne à centrifugation pour former des vésicules
-Melanger phosphatidyl choline (45 soya) et
détergent -Colonne Pierce disposable avec 2.5 ml
de matrice G50 dans tampon Hlit
6cmDl0.8cm -Pre-centrifugation dans clinical
à vitesse max, 17s gt enlèver 1-2 ml liquid
Immediatement mettre 100 ml de mélange
détergent-lipide sur la colonne pre-centrifugée
centrifugation 30s, 1/2 vitesse max.
centrifugation 45s, 3/4 vitesse max. et ensuite
collectionnes50-100 ml de vesicules -Continuer
avec léssai
Lit
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Chromatographie par exclusion de taille
Principe de la séparation
Processus de la séparation
Détergent
Vésicules
Les vésicules éluent les premiers
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Charactérisation des vésicules (par lefflux)
Cholate/CHAPS (2 colonnes nécessaires)
Échantillon ajouté 5min après la sortie de la
colonne
Lipide pur
Tx-100 ajouté
Echantillon
Temps (s)
t 0 5 min après la colonne
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1 et 5 en dessous du CMC
http//sorenandersen.org/
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• Purification

• Vésicules in vitro (détergents-lipides)

Une source de VGLUT1 plus ample? R Baculo-virus?
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Génération de Baculo-virus VGLUT1 co-transfection
de Baculo linéaire et le vecteur de transfert
pAcMP2 qui contient lADN codant pour VGLUT1
Sapphire DNA/Orbigen SD
Cellule Sf9
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C récepteur beta2-adrénergique V1 VGLUT1
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La morphologie cellulaire dune infection Baculo
Membrane Nucléaire Enveloppe Intra-nuclé. C
ytoplasme
Stroma Virogénique Polyhédra Virus Structure
fibrillaire
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• Purification

• Vésicules in vitro (détergents-lipides)

Source de VGLUT plus ample peut-être
Tester lactivité de la VGLUT1 venant de Baculo
Essai de transport avec membrane crude
(utilisant gradients H and K)
Réaction déchange avec des cellules complètes
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Essai de transport avec membrane crude
(utilisant gradients H and K)
3H-Glu
H K
C o m p/ m i n
Temps (minn2)
C récepteur beta2-adrenergic V1 VGLUT1
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Réaction déchange avec des cellules complètes
3H-Glu dans le milieu (10 mM Asp28C4E5
cellules complètes/éssai)
Idée VGLUT1 peut-être aussi sur la surface (?)
Cellule
3H-Glu
C o m p/ m i n
Temps (min)
Temps (min)
VIRUS Utilisés C récepteur beta2-adrenergique
(BVC53Kobilka) V1 VGLUT1
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VGLUT1-GFP
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Pour en savoir plus http//sorenandersen.org/
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(No Transcript)