Presentacin de PowerPoint

1
Por qué tiene que ser una caja TATA?
Nina Pastor César Millán Víctor
Capistrán Facultad de Ciencias, UAEM
2
TBP TATA binding protein
3
Ensamble del complejo de inicio de la
transcripción
4
Qué define a un buen ligando para TBP?
Secuencias flexibles
5
Interacciones directas con el surco menor del DNA
Choques estéricos entre las cadenas laterales de
TBP y el grupo amino exocíclico de las purinas
evita la asociación a pares de base CG.
6
Qué nos interesa de este sistema? cómo escoge
TBP la región de DNA para unirse? TBP se une al
surco menor del DNA qué lee TBP en el
DNA? química de los bordes de las bases
? deformabilidad de los escalones de pares de
bases ? hidratación ? cantidad de sal
condensada ?
7
Estrategia computacional
8 pares de base, con 4 bases posibles ? 48
secuencias (65536)
AT AAAAAAAAAA TA TTTTTTTTTT DAT ATATATATAT DTA TAT
ATATATA GC GGGGGGGGGG CG CCCCCCCCCC DGC GCGCGCGCGC
DCG CGCGCGCGCG DAG AGAGAGAGAG DCT CTCTCTCTCT DGA
GAGAGAGAGA DTC TCTCTCTCTC DCA CACACACACA DAC ACACA
CACAC DTG TGTGTGTGTG DGT GTGTGTGTGT
Serie de 16 ligandos que coloca cada par de
bases y cada escalón de par de bases en cada
posición de la caja TATA.
Complejos con tres proteínas humano planta levadu
ra Mantener la estructura experimental relajar
sólo la superficie de interacción bases del
DNA cadenas laterales de TBP en contacto con las
bases
8
Contribuciones a la energía libre MM - PBSA ?G
?E(covalente no covalente) ?G(solvatación
sal) T?S Ecovalente Eenlaces Eángulo de
enlace Edihedro Eimpropio Eno covalente
Evan der Waals Ecoulomb ?G(solvatación sal)
interacción de las cargas fijas entre sí
respuesta al solvente (transferencia entre ?
1 y ? 80) reorganización de la sal y
apantallamiento de las cargas
9
Ecuación de Poisson-Boltzmann potencial
electrostático generado por una distribución de
cargas fijas y móviles.
? el potencial electrostático ? la constante
dieléctrica (macromoléculas 2-4, solvente 80) ?2
8pe2I/ ?kT I es la fuerza iónica de la
solución ? densidad de cargas fijas Se obtienen
? y ? de forma autoconsistente, a partir de la
distribución espacial de las cargas fijas en la
macromolécula.
10

• Energética
• Energía libre de unión, interacción y
  deformación
• Unión ?G ?Gcomplejo - (?GTBP ?GDNA)
• Interacción ?G ?Gcomplejo - (?GTBP con DNA
  ?GDNA con TBP)
• Deformación ?GTBP ?GTBP con DNA - ?GTBP libre
• ?GDNA ?GDNA con TBP - ?GDNA libre
• TBP libre TBP en el complejo, eliminando al DNA
• DNA libre B-DNA

11
TBP prefiere marcadamente a DAT TATATATA
La energía de unión está dominada por la energía
de deformación del DNA. La energ ía de
interacción modula el reconocimiento, pero no
parece ser determinante.
12
Grupos de secuencias
DAT ATATATATAT DTA TATATATATA AT AAAAAAAAAA TA T
TTTTTTTTT DGT GTGTGTGTGT DCT CTCTCTCTCT DGA GAGAG
AGAGA DAC ACACACACAC DAG AGAGAGAGAG DCA CACACACACA
DTC TCTCTCTCTC DTG TGTGTGTGTG DGC GCGCGCGCGC DCG
CGCGCGCGCG GC GGGGGGGGGG CG CCCCCCCCCC
13
A mayor energía de deformación del DNA, mayor
ajuste conformacional
160 TATATAAA
135 DGC
Hipótesis hay ajustes conformacionales que son
incompatibles con reclutar a TFIIB ? secuencias
poco eficientes como promotores.
14
La deformación del DNA se puede aproximar a nivel
de escalones de pares de base con la energía de
stacking.
La energía libre de interacción correlaciona con
la energía potencial de interacción de los
residuos optimizados con el DNA. Se puede hacer
un análisis local tanto de interacciones como de
deformación.
15
Análisis local interacción de TBP con cada par
de bases
1 C-G -5.4 1.8 1 A-T -1.2 2.2 1 T-A
-0.7 2.1 1 G-C 1.3 2.7 2 C-G -18.6 0.7 2 T-A -
13.6 1.3 2 A-T -13.5 1.5 2 G-C
-3.2 1.2 3 C-G -16.1 1.0 3 T-A -14.4 1.1 3 A-T -1
2.6 0.8 3 G-C -10.7 1.4 4 G-C -21.3 1.5 4 A-T
-20.8 0.8 4 C-G -20.1 1.0 4 T-A -18.6 1.0
5 T-A -19.6 0.9 5 C-G -19.2 1.4 5 A-T
-18.6 2.0 5 G-C -17.4 1.4 6 A-T
-12.9 1.3 6 T-A -12.5 1.2 6 G-C
-12.2 0.5 6 C-G -10.3 1.0 7 A-T
-15.3 0.4 7 G-C -14.4 0.9 7 T-A
-12.3 0.5 7 C-G -6.1 0.8 8 G-C
-11.4 1.7 8 A-T -7.0 0.4 8 T-A
-4.4 0.9 8 C-G 0.8 0.4
consenso C C C G T A A G
En general, TBP no distingue entre AT y TA.
16
Análisis local deformación de cada escalón de
par de bases
TA 6.8 1.5 AT 13.5 3.2 TC 18.5 1.2 AC 19.1 3.3 CA
19.6 6.4 GC 21.2 5.5 AA 21.2 3.6 GA 22.1 7.4 GT 22
.2 5.4 TT 22.6 6.2 TG 22.8 1.8 CG 23.5 6.4 CT 26.6
3.3 AG 26.8 2.0 CC 32.9 3.4 GG 39.7 7.2
consenso T A T W T T W T
17
Combinando deformación e interacción
TA -21.9 2.7 TC -14.2 2.6 AT -13.4 2.0 AC -11.6 3.
8 CA -9.5 7.2 GC -9.2 4.7 TT -5.4 5.0 CT -3.8 1.5
AA -3.2 1.6 CC -2.5 2.5 GT -2.1 4.2 GA -1.9 7.2 CG
3.4 6.6 TG 4.9 0.8 AG 12.7 1.0 GG 25.6 6.7
consenso T A T A W A W G
18
Y qué hacemos con todo esto?
Tratar de explicar algún dato experimental.
19
Predicción de secuencias consenso Weblogos
20
Reproducción de afinidades relativas Non-optimal
TATA Elements Exhibit Diverse Mechanistic
Consequences Jennifer J. Stewart, Julie A.
Fischbeck , Xu Chen, and Laurie A. Stargell THE
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 281 2266522673
(2006)
castigamos a secuencias que se sabe promueven una
conformación diferente de TBP.
21
Por qué tiene que ser una caja TATA?
Porque es la secuencia que cuesta menos
deformar. El mejorar la interacción directa trae
consigo un menor costo de deformación.
22
Muestrario de simulaciones notables -un
sistema, mucho tiempo plegamiento de
proteínas fusión de membranas -un sistema,
muchas condiciones, tiempo suficiente conducción
de iones -muchos sistemas, tiempo
suficiente? microestructura de DNA
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Local structure formation in simulations of two
small proteins Guha Jayachandran, V. Vishal,
Angel E. García, Vijay S. Pande Journal of
Structural Biology 157 (2007) 491499
problema biológico rutas de plegamiento de
proteínas pequeñas compuestas por hélices
? problema computacional proceso estocástico
con tiempo característico largo idea simulación
del ensamble desnaturalizado, para identificar
intermediarios de plegamiento (foldons) y su
orden para llegar al estado nativo. coordenada
de reacción DRMSD con la estructura
cristalográfica y cantidad de residuos en
conformación helicoidal (Kabsch Sanders).
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Local structure formation in simulations of two
small proteins Guha Jayachandran, V. Vishal,
Angel E. García, Vijay S. Pande Journal of
Structural Biology 157 (2007) 491499
técnica computacional -todos los átomos,
extremos neutralizados, solvente explícito
(TIP3P), condiciones periódicas a la frontera
(caja cúbica) -DM-NPT (300 K, 1.01 bar,
algoritmo de Berendsen) -AMBER94 en GROMACS, 8 Å
de corte para interacciones de van der Waals,
suavizadas de 6 a 8 Å, campo de reacción para
interacciones de largo alcance (corte real a 10
Å, dieléctrico externo 80), LINCS para enlaces
rígidos, 2 fs paso de integración, lista de
vecinos cada 10 pasos.
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Local structure formation in simulations of two
small proteins Guha Jayachandran, V. Vishal,
Angel E. García, Vijay S. Pande Journal of
Structural Biology 157 (2007) 491499
validación del potencial 2129 dinámicas de 35 ns
de la proteína A en la estructura nativa el 98
de las dinámicas presentan un DRMSD inferior a 2
Å respecto a la estructura cristalográfica. exper
imento computacional para Proteína A 100
dinámicas de la proteína A que parten de 49
estructuras desnaturalizadas (4900 dinámicas de
35 ns) muestreo de conformaciones cada 100 ps 10
logran plegarse (definido como DRMSD menor a 2
Å). tiempo de plegamiento total estimado en 10
µs tiempo de plegamiento para un intermediario
detectado experimentalmente 300 ns
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Local structure formation in simulations of two
small proteins Guha Jayachandran, V. Vishal,
Angel E. García, Vijay S. Pande Journal of
Structural Biology 157 (2007) 491499
formación de hélices y su correlación con el
plegamiento global hélice formada ? DRMSD menor a
2 Å
vilina pobre correlación entre la formación de
las tres hélices hélice más estable 2 facilita
la formación de las otras.
las hélices se forman aún en ausencia de la
conformación nativa
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Local structure formation in simulations of two
small proteins Guha Jayachandran, V. Vishal,
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Structural Biology 157 (2007) 491499
formación de hélices y su correlación con el
plegamiento global hélice formada ? DRMSD menor a
2 Å
proteína A pobre correlación entre la formación
de las tres hélices hélice más estable 3
las hélices se forman aún en ausencia de la
conformación nativa
modelo de difusión - colisión para el plegamiento
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Local structure formation in simulations of two
small proteins Guha Jayachandran, V. Vishal,
Angel E. García, Vijay S. Pande Journal of
Structural Biology 157 (2007) 491499
la vida media de las hélices, solas o en
combinación es de 1 ns
construcción del diagrama de estados transicione
s observadas cinética a partir de dinámica
molecular
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Muestrario de simulaciones notables -un
sistema, mucho tiempo plegamiento de
proteínas fusión de membranas -un sistema,
muchas condiciones, tiempo suficiente conducción
de iones -muchos sistemas, tiempo
suficiente? microestructura de DNA
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Ensemble molecular dynamics yields
submillisecond kinetics and intermediates of
membrane fusion Peter M. Kasson, Nicholas W.
Kelley, Nina Singhal, Marija Vrljic, Axel T.
Brunger, and Vijay S. Pande PNAS 103 (2006)
1191611921
problema biológico mecanismo de fusión de
membranas, restringidas espacialmente por
proteínas tipo SNARE problema computacional
sistemas grandes y tiempos largos idea
simulación de parejas de liposomas de POPE a
diferentes distancias iniciales y observación de
la fusión membranal. Caracterización de
intermediarios y construcción de un modelo
cinético. Cálculo de energías libres para los
intermediarios. coordenada de reacción mezclado
de las lamelas exterior e interior, y del
contenido de los liposomas
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Ensemble molecular dynamics yields
submillisecond kinetics and intermediates of
membrane fusion Peter M. Kasson, Nicholas W.
Kelley, Nina Singhal, Marija Vrljic, Axel T.
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1191611921
técnica computacional -dos vesículas de POPE
de 14 nm unidas por un ligando anclado a los
fosfatos de la lamela exterior, a distancias de
1, 2, 4 o 6 nm. -átomo unido para lípidos y
agua, solvente y sal explícitos (TIP3P),
condiciones periódicas a la frontera (caja
cúbica) -DM-NPT (300 K, 1.01 bar, algoritmo de
Berendsen) -Marrink-Mark en GROMACS
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Ensemble molecular dynamics yields
submillisecond kinetics and intermediates of
membrane fusion Peter M. Kasson, Nicholas W.
Kelley, Nina Singhal, Marija Vrljic, Axel T.
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1191611921
experimento computacional 10 dinámicas de la
reacción de fusión (400 ns) caracterización de 10
estados intermedios por simulación (cada 12 ns),
para generar 100 semillas para un total de 10,000
dinámicas de la reacción de fusión (500 ns cada
una) muestreo de conformaciones cada 20
ns clustering de las conformaciones en
microestados para construir macroestados construcc
ión de la matriz de probabilidad de transición
entre estados
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Ensemble molecular dynamics yields
submillisecond kinetics and intermediates of
membrane fusion Peter M. Kasson, Nicholas W.
Kelley, Nina Singhal, Marija Vrljic, Axel T.
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ruta propuesta de la reacción de fusión
intermediario de hemifusión
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Ensemble molecular dynamics yields
submillisecond kinetics and intermediates of
membrane fusion Peter M. Kasson, Nicholas W.
Kelley, Nina Singhal, Marija Vrljic, Axel T.
Brunger, and Vijay S. Pande PNAS 103 (2006)
1191611921
la fusión es un proceso termodinámico de
bajada lo difícil es juntar las membranas
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Ensemble molecular dynamics yields
submillisecond kinetics and intermediates of
membrane fusion Peter M. Kasson, Nicholas W.
Kelley, Nina Singhal, Marija Vrljic, Axel T.
Brunger, and Vijay S. Pande PNAS 103 (2006)
1191611921
monitoreo de las coordenadas de
reacción analogía con medidas experimentales
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Ensemble molecular dynamics yields
submillisecond kinetics and intermediates of
membrane fusion Peter M. Kasson, Nicholas W.
Kelley, Nina Singhal, Marija Vrljic, Axel T.
Brunger, and Vijay S. Pande PNAS 103 (2006)
1191611921
mientras más cerca están al principio las
vesículas, más rápido y eficientemente se
fusionan.
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Muestrario de simulaciones notables -un
sistema, mucho tiempo plegamiento de
proteínas fusión de membranas -un sistema,
muchas condiciones, tiempo suficiente conducción
de iones -muchos sistemas, tiempo
suficiente? microestructura de DNA
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Ion Conduction through MscS as Determined by
Electrophysiology and Simulation Marcos
Sotomayor, Valeria Vásquez, Eduardo Perozo, and
Klaus Schulten Biophysical Journal 92 (2007)
886902
problema biológico conducción de iones a través
de un canal mecanosensible. Corresponde la
estructura cristalográfica a la conformación
conductora? problema computacional sistema
grande, tiempos grandes idea calcular
corrientes iónicas a través del canal, con
diferentes potenciales, grados de libertad para
el canal, y mutaciones puntuales. resultado
curvas corriente-potencial y conductancias para
diversas condiciones
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Ion Conduction through MscS as Determined by
Electrophysiology and Simulation Marcos
Sotomayor, Valeria Vásquez, Eduardo Perozo, and
Klaus Schulten Biophysical Journal 92 (2007)
886902
técnica computacional -heptámero de MscS en una
membrana de 299 POPC rodeada de gt50,000 moléculas
de agua (TIP3P) y 200 mM de KCl (224000 átomos)
extremos neutralizados -conformación
cristalográfica (S0) y abierta (S1) obtenidas de
simulaciones previas por 5 ns -construcción sin
el dominio citoplásmico -mutaciones puntuales y
argininas neutras -CHARMM27 en NAMD, 1 fs de
integración o 1 fs para enlaces covalentes, 2 fs
para interacciones de corto alcance y 4 fs para
interacciones de largo alcance. Corte a 12 Å para
van der Waals y PME para electrostática. Diversos
ensambles.
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Ion Conduction through MscS as Determined by
Electrophysiology and Simulation Marcos
Sotomayor, Valeria Vásquez, Eduardo Perozo, and
Klaus Schulten Biophysical Journal 92 (2007)
886902
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Ion Conduction through MscS as Determined by
Electrophysiology and Simulation Marcos
Sotomayor, Valeria Vásquez, Eduardo Perozo, and
Klaus Schulten Biophysical Journal 92 (2007)
886902
el poro responde al voltaje, a pesar de ser
mecanosensible
se abre con voltajes positivos, y en general se
colapsa sin potencial
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Ion Conduction through MscS as Determined by
Electrophysiology and Simulation Marcos
Sotomayor, Valeria Vásquez, Eduardo Perozo, and
Klaus Schulten Biophysical Journal 92 (2007)
886902
transporta cloro principalmente, y lo hace mejor
si todo el poro se mueve a backbone fijo b
todo libre conformación cristalográfica 200 pS
fuertemente rectificador, contrario al
experimento poro abierto 1 nS débilmente
rectificador
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Ion Conduction through MscS as Determined by
Electrophysiology and Simulation Marcos
Sotomayor, Valeria Vásquez, Eduardo Perozo, and
Klaus Schulten Biophysical Journal 92 (2007)
886902
potencial electrostático promedio calculado para
TODAS las cargas estructura cristalográfica pote
ncial externo de -0.6V
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Ion Conduction through MscS as Determined by
Electrophysiology and Simulation Marcos
Sotomayor, Valeria Vásquez, Eduardo Perozo, and
Klaus Schulten Biophysical Journal 92 (2007)
886902
con -1.2 V, el cloro pasa, el potasio no entra, y
el agua pasa libremente.
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Muestrario de simulaciones notables -un
sistema, mucho tiempo plegamiento de
proteínas fusión de membranas -un sistema,
muchas condiciones, tiempo suficiente conducción
de iones -muchos sistemas, tiempo
suficiente? microestructura de DNA
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Molecular Dynamics Simulations of the 136 Unique
Tetranucleotide Sequences of DNA
Oligonucleotides. II Sequence Context Effects on
the Dynamical Structures of the 10 Unique
Dinucleotide Steps Surjit B. Dixit, David L.
Beveridge, David A. Case, Thomas E. Cheatham 3rd,
Emmanuel Giudice, Filip Lankas, Richard Lavery,
John H. Maddocks, Roman Osman, Heinz Sklenar,
Kelly M. Thayer,and Péter Varnai Biophysical
Journal 89 (2005) 37213740
problema biológico microestructura del DNA y su
dependencia con la secuencia de nucleótidos.
Cuál es la unidad mínima descriptiva? problema
computacional muchos tetranucleótidos, mucho
tiempo idea simular al menos dos copias de cada
tetranucleótido, inmersos en oligos de 15
nucleótidos para minimizar efectos de
borde resultado efectos de contexto para los 16
escalones de pares de bases, y análisis de
problemas de cuasi-ergodicidad
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Molecular Dynamics Simulations of the 136 Unique
Tetranucleotide Sequences of DNA
Oligonucleotides. II Surjit B. Dixit, et
al. Biophysical Journal 89 (2005) 37213740
técnica computacional -39 oligos de 15
nucleótidos, forma B canónica, con pares de base
GC en los extremos, sin fosfatos 5, 28 K como
contraiones en posiciones aleatorias al menos a 5
Å del DNA, condiciones periódicas a la frontera,
caja de octaedro truncado, 8000 moléculas de
agua (TIP3P). 24,000 átomos. diseño de los
oligos ABCDABCDABCD contiene los
tetranucleótidos ABCD, BCDA, CDAB y
DABC -AMBER94, en AMBER 6 o 7,
PME -trayectorias de 15 ns, NPT, algoritmo de
Berendsen, SHAKE, 2 fs para integración. -conform
aciones analizadas cada 1 ps.
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Molecular Dynamics Simulations of the 136 Unique
Tetranucleotide Sequences of DNA
Oligonucleotides. II Surjit B. Dixit, et
al. Biophysical Journal 89 (2005) 37213740
hay subestados definidos por la conformación del
backbone vida media de BI 920 ps
BII 200 ps ? y ? no están bien muestreados en
15 ns
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Molecular Dynamics Simulations of the 136 Unique
Tetranucleotide Sequences of DNA
Oligonucleotides. II Surjit B. Dixit, et
al. Biophysical Journal 89 (2005) 37213740
distribuciones multimodales de varios parámetros
familias estructurales
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Molecular Dynamics Simulations of the 136 Unique
Tetranucleotide Sequences of DNA
Oligonucleotides. II Surjit B. Dixit, et
al. Biophysical Journal 89 (2005) 37213740
hay secuencias particularmente buenas para
adquirir conformaciones poco comunes
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Molecular Dynamics Simulations of the 136 Unique
Tetranucleotide Sequences of DNA
Oligonucleotides. II Surjit B. Dixit, et
al. Biophysical Journal 89 (2005) 37213740
diferencias en el backbone se reflejan en la
geometría de los escalones distribuciones
bimodales
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Molecular Dynamics Simulations of the 136 Unique
Tetranucleotide Sequences of DNA
Oligonucleotides. II Surjit B. Dixit, et
al. Biophysical Journal 89 (2005) 37213740
algunos escalones son más sensibles al contexto
que otros