Sin ttulo de diapositiva

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Biotecnología Vegetal

• La biotecnología consiste en la utilización de
  organismos vivos con fines industriales

• Conjunto de técnicas que utilizan organismos
  vivos o parte de ellos para obtener productos o
  modificarlos, para mejorar plantas o animales, o
  para desarrollar microorganismos con fines
  determinados

• Se utilizan las técnicas de ingeniería genética
  y cultivo de tejidos vegetales in vitro

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Planta transgénica Se introduce un DNA foráneo en
el genoma de sus células, este DNA se expresa y
confiere a la planta un carácter o unos
caracteres nuevos
Sistemas de transformación genética en plantas

• Sistemas de transferencia de ADN basados
• en vectores biológicos
• - Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens
• y Agrobacterium rhizogenes.
• - Sistemas basados en virus
  vegetales.
• Sistemas de transferencia directa de ADN
• - Transferencia por biobalística.
• - Transferencia mediada por
  cationes divalentes
• y/o electroporación
• - Transferencia por
  microinyección.

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Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
Tumor de tallo provocado por Agrobacterium
tumefaciens
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Agrobacterium tumefaciens Bacteria Gram negativa
que infecta a las plantas en lugares donde hay
heridas y produce la enfermedad de las agallas en
corona, fundamentalmente en Dicoteledóneas.
Las agallas son protuberancias formadas por
conglomerados de células indeferenciadas
El plásmido Ti es el responsable de la inducción
de tumores, durante la infección se transfiere
una porción definida de este plásmido T-DNA
(DNA de transferencia)
La integración y expresión de ciertos genes del
T-DNA (oncogenes) hace que las células
transformadas se dividan sin control. Codifican
para la síntesis de fitohormonas (auxinas y
citoquininas) y de opinas (fuente de C y N para
la bacteria).
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(No Transcript)
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Se inocula con Agrobacterium desarmada que
contenga un vector de transformación. El T-DNA
contiene un módulo de expresión y el gen de
resistencia a la kanamicina El medio además de
hormonas debe contener el antibiótico cefotaxima
(para controlar el crecimiento de Agrobacterium)
y kanamicina (antibiótico de selección)
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(No Transcript)
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Cultivo de raíces de tabaco transformadas por
Agrobacterium rhizogenes
Agrobacterium rhizogenes
En este caso se utiliza como vector de
transformación la bacteria con su plásmido Ri
intacto y además se introduce otro plásmido que
contiene los genes quiméricos dentro del T-DNA.
Puede dar fenotipos aberrantes en la parte aérea
de la planta
Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus
Gentileza del Dr. Mark Tepfer
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(No Transcript)
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Potencial económico de los metabolitos secundarios
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Cultivo de tejidos y metabolismo secundario
El metabolismo secundario regula muchas de las
relaciones de la planta con el medio circundante
Concepto general

• La producción de metabolitos secundarios está
  estrechamente
• relacionada con el proceso de desarrollo de la
  planta.
• - Generalmente no está asociada al crecimiento.
• - Depende de condiciones determinadas de control
  hormonal.
• - Es paralela al desarrollo de tejidos
  especializados y órganos
• (raíces, tallos, hojas y glándulas).
• La biosíntesis y acumulación suele estar
  fuertemente
• compartimentalizada a nivel intracelular,
  celular, de tejidos
• y de órganos.
• Los metabolitos secundarios se producen ante
  situaciones
• de estrés o enfermedad.
• - Factores bióticos
• - Factores abióticos

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Las plantas como fuente de metabolitos
secundarios de interés comercial
- Insecticidas - Saborizantes - Colorantes
- Medicinas - Herbicidas - Proteasas
- Fragancias - Antimicrobianos - Enzimas

• Potencial
• - 75 de las nuevas estructuras químicas
  descubiertas provienen de las plantas.
• - Sólo se tiene buen conocimiento de 5.000
  de las 250.000-300.000 especies vegetales que
  se creen existentes en el planeta.
• - 25 de los medicamentos de las industrias
  farmacéuticas son de origen vegetal.
• - 75 de la población mundial utiliza la
  medicina tradicional que consiste
  principalmente en el uso de extractos
  provenientes de plantas.

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Algunas de las medicinas más importantes o sus
precursores derivados de plantas y sus ventas en
el 2002
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Producción de metabolitos secundarios por cultivo
in vitro de células
y órganos vegetales por qué?

• - Independizarse de factores externos tales como
• cambios de temperatura, sequías, plagas,
• variabilidad de la producción, factores
  políticos
• y sociales, etc.
• - Evitar la extinción de especies vegetales.
• Disponer de condiciones controladas en el
  proceso
• de producción y extracción.
• - Posibilitar el mejoramiento vegetal en tiempos
• mas cortos.
• Hacer viable la producción de compuestos
• complejos con uno o más C quirales en forma más
• económica respecto de la síntesis química
• - Posibilitar la obtención de nuevos compuestos
• no presentes en la planta madre.

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Procesos industriales
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Viabilidad de un proceso para su escalado a
nivel industrial

• Condiciones económicas
• Compuestos de alto precio (gt1.000 US/kg)
• Alto rendimiento y productividad del cultivo
• comparado con la planta entera
• Buen crecimiento en biorreactores
• Crecimiento lento de la planta entera
• como fuente alternativa
• Parámetros principales
• Productividad g de producto/L/día
• Concentración máxima de producto
• g de producto/L

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Estrategias para incrementar la producción de
metabolitos secundarios
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Metodologías utilizadas para optimizar la
producción de metabolitos secundarios

• Selección de especies vegetales apropiadas
• Selección de líneas celulares mejoradas
• Optimización de las condiciones de cultivo
• Agregado de precursores
• Tipo de cultivo suspensiones, órganos
• o células inmovilizadas
• Uso de elicitores microbianos
• y estrés abiótico
• Permeabilización y remoción in situ

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Metodologías utilizadas para optimizar la
producción de metabolitos secundarios

• Screening y selección de líneas sobreproductoras
• - Se facilita cuando el metabolito de interés es
  un
• pigmento, ya que puede hacerse
  una selección
• visual.
• - Es importante contar con un método rápido y
  sencillo
• para seleccionar líneas más productoras (por
  ejemplo,
• ELISA).
• Optimización del medio de cultivo (variables más
• ensayadas)
• - Fuente de carbono
• - Limitación en nitrógeno
• - Limitación en fosfato
• - Hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas)
• - Relación C/N
• Agregado de precursores

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Diferencias entre suspensiones de células
vegetales y de células microbianas
Tomado de Scraag.. Plant Biotechnology, 1992.
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Cultivos en suspensión

• Problemas a considerar
• - Tasa de crecimiento
• - Volumen del inóculo
• - Tamaño y agregación de las células
• - Oxigenación
• - Agitación

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Cultivo de órganos raíces transformadas
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Algunos metabolitos secundarios producidos por
raíces transformadas
Tomado de Hairy Roots, Culture and Application,
1997.
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Elicitación

• Agentes bióticos
• - Extractos de paredes de hongos o bacterias
• - Acido araquidónico
• - Quitosano
• - Metil jasmonato
• Agentes abióticos
• - Metales pesados
• - Radiación UV
• - Presión osmótica
• - Ultrasonido

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Liberación del producto al medio

• DMSO
• Shock térmico
• Cambios de pH
• Limitación de fosfato y oxígeno
• Elicitación
• - Detergentes y aceites de siliconas
• Electropermeabilización

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Remoción de producto in situ

• Líquido-líquido
• Compuestos inmiscibles en agua, como solventes
• orgánicos o lípidos (sistemas de dos fases
  agua-orgánico).
• Ejemplos migliol, hexadecano, dodecano.
• Compuestos miscibles en agua, como sales o
  soluciones
• de polímeros (sistemas de dos fases acuosas).
  Ejemplos DEAE, PEG.
• Sólido-líquido
• La segunda fase es un material sólido como
  resinas u otros
• absorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18,
  etc.
• Requerimientos
• - Autoclavables
• - No tóxicos
• - Fácil separación del producto de interés
  de la segunda fase

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Secuencia en la optimización de un proceso para
la producción de metabolitos secundarios
Selección de la planta por su contenido de
metabolitos secundarios para iniciar cultivos in
vitro
Establecimiento de cultivos in vitro
Estabilización y selección de cultivos in vitro
velocidad de crecimiento, niveles de producto,
liberación al medio
Optimización de medio de cultivo para
producción por diseño factorial nutrientes,
precursores, elicitación, liberación y remoción
in situ
Optimización en bioreactores escalado Sistema de
cultivo batch, continuo, fed-batch,
perfusión, en dos etapas. Extracción y
purificación del producto
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Estrategias para modificar el metabolismo
secundario mediante manipulación genética

• Completar rutas metabólicas mediante
• inserción de genes heterólogos.
• - Amplificar rutas normales.
• - Bloquear rutas alternativas.
• - Bloquear rutas normales.
• - Modificar la regulación de rutas normales.
• - Modificar los mecanismos de secreción
• y exportación.
• - Bloquear rutas de degradación.

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Ingeniería metabólica del metabolismo secundario
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Producción de shikonina por suspensiones
celulares de Lithospermum erythrorhizon
(colorante-cicatrizante)
Yamasaki Plant Photo Gallery

• Planta entera
• - La extracción se realiza en plantas de
  aproximadamente 3 años.
• Suspensiones celulares
• - 2,4-D estimula el crecimiento pero no la
  producción.
• - Las bajas concentraciones de nitrógeno y la
  elicitación inducen
• la producción de shikonina.
• - Se utilizan fermentadores de agitación
  mecánica y tambor rotatorio.
• - La productividad de shikonina es 840 veces
  superior a la de planta entera.

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Conclusiones

• Aspectos bioingenieriles
• - Diseño de bioreactores especiales para
  cultivos de tejidos vegetales
• - Instrumentación y control de los bioprocesos
• - Diseño de bioreactores más económicos
• - Métodos no letales para liberación
• de los metabolitos secundarios
• - Método adecuado para la remoción in situ
• Aspectos Biológicos
• - Conocimiento de la regulación de las rutas
  biosintéticas enzimas y factores de
  transcripción
• - Conocimiento de la regulación del transporte
• y acumulación de los metabolitos secundarios
• - Conocimientos de los mecanismos
• de degradación del producto

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Expresión de proteínas heterólogas en
plantas(Molecular Farming)

• bajos costos de producción.
• tiempos menores para poner en el mercado.
• abastecimiento ilimitado.
• procesamiento correcto de proteínas.
• seguridad.

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Expresión de proteínas heterólogas en
plantas(Molecular Farming)
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Fitorremediación

• Ventajas
• Las plantas pueden ser utilizadas como bombas
  extractoras de bajo costo para depurar suelos y
  aguas
• contaminadas (10-20 del costo de métodos
  tradicionales)
• - las plantas emplean energía solar
• - el tratamiento es in situ
• Algunos procesos degradativos ocurren en forma
  más rápida con plantas que con microorganismos.
• Es un método apropiado para descontaminar
  superficies grandes o para finalizar la
  descontaminación de áreas restringidas en plazos
  largos.
• Es una metodología con buena aceptación pública.
• Se generan menos residuos secundarios.

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Fitorremediación

• Limitaciones
• El proceso se limita a la profundidad de
  penetración
• de las raíces o a aguas poco profundas.
• La fitotoxicidad es un limitante en áreas
  fuertemente contaminadas.
• Los tiempos del proceso pueden ser muy
  prolongados.
• La biodisponibilidad de los compuestos o metales
• es un factor limitante de la captación.
• Deben considerarse potenciales contaminaciones
• de la cadena alimentaria y napas de agua.
• Se requiere comprender mejor la naturaleza
• de los productos de degradación
  (fitodegradación).
• Falta elaborar el marco regulatorio.

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Biología de la acumulación de metales en plantas

• Captación por las raíces
• - Movilización de los metales
• Quelación mediante fitosideróforos
• Unión a proteínas quelantes
• Acidificación por exudado de H
• - Captación por la raíz
• Via apoplástica
• Vía simplástica
• Transporte
• - Almacenamiento en raíz y exportación al tallo
  por xilema
• - Transporte por xilema o redistribución por
  floema
• - Almacenamiento en vacuolas
• Mecanismos de evasión o tolerancia
• - Captación celular limitada (evasión)
• - Metabolismo resistente a metales pesados
• - Detoxificación por quelación,
  compartimentalización
• o precipitación
• Mecanismos más probables

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Tipos de plantas más utilizadas Freatófitas -
Plantas de raíces profundas (álamo, sauce,
algodonero). Pasturas - Por su tipo de raíz
retienen el suelo. Legumbres - Permiten
enriquecer el suelo en N2. Acuáticas - Permiten
la degradación de contaminantes en ciénagas
artificiales.
Fitorremediación
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• Fitoextracción
• Las plantas se usan para concentrar metales en
  las partes cosechables (principalmente, la parte
  aérea).
• Rizofiltración
• Las raíces de las plantas se usan para absorber,
  precipitar y concentrar metales pesados a partir
  de efluentes líquidos contaminados.
• Fitoestimulación
• Se usan los exudados radiculares para promover el
  desarrollo
• de microorganismos degradativos (bacterias y
  hongos).
• Fitoestabilización
• Las plantas tolerantes a metales se usan para
  reducir la movilidad de los mismos y evitar el
  pasaje a napas subterráneas o al aire.
• Fitotransformación
• - Fitodegradación Las plantas acuáticas y
  terrestres captan, almacenan y degradan
  compuestos orgánicos para dar subproductos no
  tóxicos o menos tóxicos.
• - Fitovolatilización Las plantas captan y
  modifican metales pesados o compuestos orgánicos
  y los liberan a la atmósfera
• con la transpiración.

Tipos de fitorremediación
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Tipos de fitorremediación
Tomado de McCutcheon, PBI Bulletin 1998.