Sin ttulo de diapositiva

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Pontificia Universidad Católica de Chile Programa
de Doctorado en Ciencias Biológicas Mención
Genética Molecular y Microbiología Seminario
Departamental Profesor encargado Dr. Francisco
Melo
Regulación del factor ?S (RpoS) por RNAs no
codificantes en enterobacterias
Juan Fuentes Aravena
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Nomenclatura
Cursiva minúscula genes (rpoS) Cursiva
mayúscula sRNAs (DsrA, RprA, OxyS) Mayúscula
Proteínas (Hfq, RpoS)
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Señales ambientales diversas
Circuitos reguladores Proteínas que
participan en la transcripción
Respuesta que permite adaptación al medio
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Factores ?
La RNA polimerasa bacteriana es capaz de
seleccionar y reconocer diferentes tipos de
promotores en base al tipo de factor ? con cual
interactúa En respuesta a un amplio rango de
estímulos, el core de la RNA polimerasa puede
interactuar con un factor ? o con otro, lo que
permitiría realizar una transcripción diferencial
(Loewen, 1998) La expresión de una familia
entera de genes puede ser controlada afectando la
tasa de la producción de un factor ? dado
(Loewen, 1998)
5
Factor ?
6
Factor ?s
El factor también ?s también es conocido como
RpoS o ?38 Es requerido para la transcripción de
genes expresados durante el inicio de la fase
estacionaria de crecimiento en enterobacterias
(Loewen, 1998) Experimentalmente se ha visto que
el agotamiento de nutrientes, la baja
disponibilidad de oxígeno, estrés ácido, estrés
oxidativo y alta osmoralidad pueden incrementar
su expresión (Lange, 1995 Hengge-Aronis, 1999)
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Estructura secundaria del mRNA que codifica para
el Factor ?s
(Brown, 1996)
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Estructura secundaria de Factor ?s (RpoS)
La traducción del mRNA RpoS disminuye
drásticamente cuando las células son mutantes en
Hfq, una proteína que se une a RNA y facilita la
interacción RNA-RNA (Brown, 1996) Notablemente,
mutantes supresoras de Hfq- que permiten la
expresión de RpoS no presentan estructura
secundaria en la región 5 del mRNA de RpoS
(Brown, 1996)
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Existen RNAs que cumplen función reguladora
Estos RNAs estás constituidos de aprox. 100
nucleótidos, por lo que se denominan sRNAs (por
small RNAs) Tienen la capacidad de regular
expresión de genes mediante diversos mecanismos,
generalmente a nivel post-transcripcional (Brown,
1996) Existen al menos 50 sRNAs descritos en
Escherichia coli (Repoila, 2003) Algunos de
estos RNAs regulatorios afectan a proteínas que
son en sí reguladores globales, participando como
sintonizadores finos (Nogucira, 2000)
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Resumen
DsrA y RprA son sRNAs que activan la traducción
del mRNA RpoS y ambos son capaces de
desestabilizar el apareamiento intramolecular de
este mensajero. El sRNA OxyS inhibe la
traducción del mensajero de RpoS aunque su
mecanismo de acción es desconocido Estos tres
sRNAs requieren la proteína Hfq para funcionar,
lo que explicaría el requerimiento de ésta para
la traducción del mRNA RpoS
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DsrA y RprA sRNAs activadores de la traducción
de RpoS
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DsrA
DsrA es un sRNA de 85 nucleótidos bastante
conservado en enterobacterias cuya estructura
secundaria está constituida de tres tallos
(stem-loops)
(Majdalani, 1998 Lease, 2000)
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RprA
RprA es un sRNA de 106 nucleótidos que fue
descubierto por ser capaz de revertir
parcialmente la ausencia de DsrA en la
estimulación de la traducción de mRNA RpoS
(Majdalani, 2001)
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Fusión traduccional
Sitio de unión al ribosoma
Reportero lacZ en marco
3
5
Transcripción
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Fusión transcripcional
Sitio de unión al ribosoma
Reportero lacZ
3
5
Transcripción
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DsrA y RprA aumentan la expresión de RpoS a
nivel traduccional
100
100
relativo a WT de actividad ?-galactosidasa
50
50
WT dsrAcat rprAcat
WT dsrAcat rprAcat
RpoSLacZ fusión traduccional
rpoSlacZ fusión transcripcional
(datos de Sledjeski, 1996 Majdalani, 2002)
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DsrA y RprA regulan la traducción del mRNA de
RpoS por interacción RNA-RNA
(Majdalani, 1998 Majdalani, 2000)
18
DsrA y RprA regulan la traducción del mRNA de
RpoS por interacción RNA-RNA
(Majdalani, 1998 Majdalani, 2001)
19
Hfq
Hfq es una proteína que tiene la capacidad de
unirse a RNA y está bastante conservada en
enterobacterias (Moller, 2002) Se ha descrito
que es capaz de estabilizar interacciónes RNA-RNA
sólo cuando hay complementariedad de bases
(Zhang, 2002) Se demostró que existen aprox.
30.000 moléculas de Hfq por célula y que éstas se
agrupan formando hexámeros, por lo que habría
aprox. 5.000 complejos por célula (Katijani,
1994 Zhang, 2002)
20
Hfq tiene una estructura hexamérica
(Zhang, 2002)
21
Hfq es esencial para la traducción del mRNA de
RpoS
Se describió que mutantes Hfq- presentan una
disminución drástica en la expresión de RpoS al
disminuir la traducción de este último (Brown,
1996) Se ha demostrado, además, que mutantes que
eliminaban el apareamiento intramolecular de la
secuencia líder de RpoS se hacían
indepentendientes de Hfq (Brown, 1996)
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Hfq es necesaria para la activación de la
expresión del mRNA de RpoS mediante DsrA y RprA
(Sledjeski, 2001)
23
Hfq interactúa con DsrA y RprA in vitro
(Brescia, 2003)
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DsrA y RprA modulan la expresión de RpoS en
distintas condiciones ambientales
DsrA es esencial para la acumulación de RpoS a
bajas temperaturas (Sledjeski, 1996) RprA está
activa la expresión de RpoS bajo estrés en la
membrana (ej. Alta osmoralidad) (Majdalani,
2002) Esta modulación está dada por el
incremento en la transcripción de los sRNAs en
las condiciones ambientales descritas (Sledjeski,
1996 Majdalani, 2002) DsrA y RprA regularían la
traducción de RpoS bajo distintas condiciones
ambientales
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OxyS sRNA inhibidor de la traducción de RpoS
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OxyS
OxyS es un sRNA de 109 nucleótidos cuya
estructura secundaria está constituida de 3
tallos
(Zhang, 1998)
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OxyS disminuye la expresión de RpoS a nivel
traduccional
RpoSLacZ fusión traduccional
rpoSlacZ fusión transcripcional
(datos de Zhang , 1998)
28
OxyS no se une al mensajero de RpoS in vitro
DsrA y RprA pueden unirse al mensajero de RpoS
mediante secuencias homólogas (Majdalani, 1998
Majdalani, 2000) OxyS no presenta secuencias
homólogas con el mRNA de RpoS (Zhang, 2002) OxyS
no se une al mensajero de RpoS in vitro (Zhang,
2002)
29
Hfq es necesaria para la inhibición de la
traducción del mRNA de RpoS mediante OxyS
(datos de Zhang, 1998)
30
OxyS no afecta la producción de Hfq
(Zhang, 1998)
31
Hfq interactúa con OxyS in vitro
(Zhang, 2002)
32
Análisis de mutantes OxyS
Fusión traduccional RpoSLacZ
(Zhang, 1998)
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OxyS actúa en presencia de estrés oxidativo
En presencia de peróxido de hidrógeno, la
transcripción de OxyS aumenta (Altuvia, 1997), lo
que conlleva a la represión de la traducción de
RpoS Se estimó que aproximadamente 4.500
moléculas de OxyS se acumulan en la célula
después de un corto tiempo de exposición a estrés
oxidativo (Altuvia, 1997) Esto haría una razón
de aprox. 11 con los hexámeros de Hfq en esta
condición
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Resumen de los antecedentes
1.- DsrA y RprA activan la traducción del mRNA de
RpoS al desestabilizar la estructura secundaria
del extremo 5 de este mensajero 2.- OxyS inhibe
la traducción del mRNA que codifica para
RpoS 3.- OxyS no presentan apareamiento con el
mRNA de RpoS 4.- Los sRNAs DsrA, RprA y OxyS
requieren de Hfq para actuar 5.- Hfq es capaz de
unirse a los tres sRNAs 6.- OxyS no afecta la
producción de Hfq 7.- En presencia de estrés
oxidativo, la razón entre la cantidad de
hexámeros Hfq y OxyS es aproximadamente 11
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Hipótesis
OxyS regula la expresión de RpoS inhibiendo la
traducción de su mensajero mediante el secuestro
del factor Hfq
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Objetivos
1.- Determinar si OxyS es capaz de variar la
estabilidad del mRNA de RpoS 2.- Determinar si
OxyS puede competir por Hfq a) Determinar si
OxyS puede competir con DsrA y RprA para unir Hfq
in vitro b) Determinar si OxyS puede competir
por Hfq in vivo en distintas condiciones de
crecimiento de la bacteria 3.- Determinar si
OxyS requiere secuestrar a Hfq para inhibir la
traducción de RpoS a) Determinar si mutantes en
OxyS que tienen disminuida su capacidad de
inhibir la traducción de RpoS tienen menos
afinidad por Hfq b) Determinar si el efecto
inhibitorio de OxyS es dependiente del balance
Hfq / OxyS
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Objetivo 1
1.- Determinar si OxyS es capaz de variar la
estabilidad del mRNA de RpoS
38
Estrategia experimental y resultados esperados
Cultivo bacteriano tratado con rifampicina
(inhibición de la transcripción) Alícuotas
tomadas a distintos tiempos Detección del mRNA de
RpoS por hibridación Northern
39
Objetivo 2
2.- Determinar si OxyS puede secuestrar a
Hfq a) Determinar si OxyS puede competir con
DsrA y RprA para unir Hfq in vitro
40
Estrategia experimental y resultados esperados
Gel de retardo y competencia con RNAs fríos
DsrA RprA
41
Objetivo 2
2.- Determinar si OxyS puede secuestrar a
Hfq b) Determinar si OxyS puede competir por
Hfq in vivo en distintas condiciones de
crecimiento de la bacteria
42
Estrategia experimental y resultados esperados
Coinmunoprecipitación de Hfq y sRNAs en distintas
condiciones de cultivo
DsrA RprA OxyS
DsrA RprA OxyS
DsrA RprA OxyS
43
Objetivo 3
3.- Determinar si OxyS requiere secuestrar a Hfq
para inhibir la traducción de RpoS a)
Determinar si mutantes en OxyS que tienen
disminuida su capacidad de inhibir la traducción
de RpoS tienen menos afinidad por Hfq
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Estrategia experimental y resultados esperados
Hacer mutantes de OxyS y analizar posible pérdida
en la capacidad de inhibir la traducción de RpoS.
Correlacionar con afinidad por Hfq
45
Objetivo 3
3.- Determinar si OxyS requiere secuestrar a Hfq
para inhibir la traducción de RpoS b)
Determinar si el efecto inhibitorio de OxyS es
dependiente del balance Hfq / OxyS
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Estrategia experimental y resultados esperados
Western Northern
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Conclusiones
Al menos tres sRNAs diferentes regulan la
traducción de RpoS DsrA, RprA y OxyS El
ejemplo de la regulación de RpoS provee evidencia
de cómo la célula puede integrar y responder a
una gran variedad de señales ambientales sin
tener que evolucionar controles de transcripción
complejos La existencia de al menos 50 sRNAs en
Escherichia coli apunta a que muchos otros
efectos reguladores a nivel traduccional están
mediados por este tipo de moléculas mediante
distintos mecanismos