Sin t

1
Polinucleótidos
2
Extremo 5
Polinucleótido
Enlace fosfodiéster
Extremo 3
3
Formas de representación de polinucleótidos
5- CpApTpTpGpCpGpGpApApTpGpCpCp -3
5-CATTGCGGAATGCC-3 3-GTAACGCCTTACGG-5
4
3
5
Polinucleótido en doble hélice
5
3
5
Propiedades de los polinucleótidos, 1
1. Absorción de luz UV a 260 nm
Hipocromismo
A260,
120
En el DNA doble hélice se da el fenómeno de
hipocromismo el DNA desnaturalizado por el
calor absorbe un 20-30 más que el DNA nativo
110
100
T (ºC)
6
Propiedades de los polinucleótidos, 2
2. Reacción positiva de los polidesoxirribonucleót
idos a la difenilamina y al reactivo de
Schiff 3. Reacción positiva de los
polirribonucleótidos al orcinol 4. Reacción con
agentes intercalantes (acridinas) 5. Hidrólisis
completa del RNA con álcali el DNA es
resistente a álcali.
7
Rotura química de polinucleótidos
- Tratando un polinucleótido (DNA) con dimetil
sulfato (DMS) tiene lugar la metilación de
purinas por calentamiento a pH neutro se rompe
el enlace glicosídico y queda un sitio apurínico
el tra- tamiento ulterior con ácido diluído rompe
la cadena por el sitio apurínico. - Tratando un
polinucleótido (DNA) con hidrazina se rompe el
enlace glicosídico de las pirimidinas, quedando
un sitio apirimi- dínico el tratamiento ulterior
con piperidina rompe la cadena por el sitio
apirimidínico.
8
(No Transcript)
9
Calentamiento
10
(No Transcript)
11
Rotura enzimática de polinucleótidos
Endonucleasas atacan enlaces fosfodiéster
situados en el interior de una cadena
polinucleotídica, y suelen ser específicas de
cada ácido nucleico - Ribonucleasas -
Desoxirribonucleasas Exonucleasas atacan
enlaces fosfodiéster situados en los extremos (3
o 5) de una cadena polinucleotídica, y
suelen atacar indistintamente ambos tipos de
ácidos nucleicos - Exonucleasa de bazo (rotura
tipo b) - Exonucleasa de veneno de serpiente
(rotura tipo a)
12
Rotura tipo a Da lugar a una mezcla
de 5-nucleótidos
13
Rotura tipo b Da lugar a una mezcla
de 3-nucleótidos
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Endonucleasas DNAasa I rotura completa, tipo
a DNAasa II rotura completa, tipo b RNAasa
pancreática rompe (b) enlaces Py-X RNAasa T-1
rompe (b) enlaces G-X Endonucleasas de
restricción Exonucleasas Exonucleasa de bazo
libera 3-nucleótidos Exonucleasa de veneno de
serpiente libera 5-nucleótidos
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Endonucleasas de restricción, 1
1. Reconocen secuencias específicas, por lo
general palindrómicas
5- ATCGTTGCCTACAATTGAATTCCCAATAACCCTT -3 3-
TAGCAACGGATGTTAACTTAAGGGTTATTGGGAA -5
La secuencia reconocida en este caso es GAATTC
16
Endonucleasas de restricción, 2
2. Suelen romper el polinucleótido dejando
extremos cohesivos
5- ATCGTTGCCTACAATTGAATTCCCAATAACCCTT -3 3-
TAGCAACGGATGTTAACTTAAGGGTTATTGGGAA -5
AATTCCCAATAACCCTT -3 GGGTTATTGGGAA -5
5- ATCGTTGCCTACAATTG 3- TAGCAACGGATGTTAACTTAA
Lo que permite la soldadura de fragmentos de DNA
rotos por la misma endonucleasa de restricción
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Endonucleasas de restricción, 3
3. Al reconocer secuencias relativamente largas,
cortan el DNA por un número muy limitado de
sitios, lo que facilita la manipula- ción
experimental del mismo.
Algunas endonucleasas de restricción
EcoRI GAATTC ClaI ATCGAT HaeIII GGCC RsrII CGG
ATCCG
18
Supongamos la secuencia reconocida por la
endonucleasa de restricción EcoRI, que es
5-GAATTC-3
En un DNA que contenga 30 de A, 30 de T, 20
de G y 20 de C, la probabilidad de encontrar
esta secuencia al azar sería de
0.2 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.2 0.000324
O lo que es lo mismo, aproximadamente una cada
3086 nucleótidos
19
Separación electroforética de fragmentos de
restricción del DNA. Una vez separados, se
tratan con bromuro de etidio (un agen- te
intercalante) y se observan bajo luz UV.
20
Método de Sanger para secuenciación de
polinucleótidos
21
(No Transcript)
22
Síntesis en presencia de ddGTP
23
Síntesis en presencia de ddATP
24
Síntesis en presencia de ddCTP
25
Síntesis en presencia de ddTTP
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A continuación, las cuatro mezclas se someten a
electroforesis en poli- acrilamida-SDS. Este
método sepa- ra polinucleótidos en función de
su tamaño, de forma que los más cortos se
desplazan más rápidamente. Como el cebador está
marcado radioactiva- mente, revelamos la plancha
de electroforesis por autorradiografía.
Con esto leemos directamente la secuencia
complementaria del poli- nucleótido
inicial 5-AAGGCACATTCGATGCAAT- CGAATCGAACGTCCCA
AAAG- GATTCCGGGAAAATG-3