Bibliografia Marcadores Moleculares

1
Bibliografia Marcadores Moleculares

• Killops, S, Killops, V. 2005. Introduction to
  organic geochemistry 2nd Edition Chapter 5
  Chemical stratigraphic concepts and tools p
  166-245 Blackwell U.K
• Poynter, J, Eglington, G 1991 The biomarker
  concept-strenghts and weaknesses . Fresenius J
  Anal. Chem 339725-731

2
Bibliografia

• Brocks J.J, Summons, R.E 2005 Sedimentary
  hydrocarbons, biomarkers for early life Chapter
  8.03 p 64-114 IN Vol 8 Biogeochemisrty -
  Treatise on Geochemistry. Elsevier 701p

3
Geoquímica orgânica

• Básicamente é o estudo das reações e processos
  que ocorrem com as moléculas orgânicas no no
  Sistema Terra.
• Os processos são tanto mediados biológicamente ou
  ainda controlados pelas variáveis simples como a
  Temperatura e Pressão, no caso dos orgânicos
  ocluídos no interior da Terra.

4
Vida , moléculas e registros geológicos

• A vida deixa tanto registros físicos visíveis a
  olho nú( esqueletos, carapaças), ou ao
  microscópio(microalgas) ou ainda moléculas
  orgânicas fósseis no registro sedimentar.
• Os fósseis quimicos ou marcadores moleculares,
  podem dar indicações precisas da sua origem
  biológica inicial a partir da sua composição
  isotópica e da estrutura molecular.Podem ainda
  estimar as condições ambientais reinantes no
  passado geológico.

5
Marcadores Moleculares Orgânicos

• São moléculas orgânicas encontradas em
  sedimentos,rochas, betume ou petróleo que não
  sofreram alterações significativas na sua
  estrutura básica original que apresentavam nos
  organismos vivos.
• Em outras palavras a assinatura química original
  é preservada apesar dos processos biológicos ou
  geoquímicos a que foram submetidas.

6
Marcadores Moleculares- Histórico

• O primeiro relato de um marcador molecular é de
  1934 quando Treibs isolou moléculas de porfirinas
  tanto do petróleo como de sedimentos marinhos
  antigos e associou os fatos. A origem das
  porfirinas de ambas matrizes é a mesma a
  molécula original da clorofila.

7
(No Transcript)
8
(No Transcript)
9
Papel biológico porfirinas

• O núcleo básico da porfirina, que é um anel plano
  com 12 átomos de C e 4 de N no centro, é a base
  da construção de vários pigmentos de grande
  importância bioquímica. No caso da clorofila o Mg
  é o metal complexado no centro do anel. Na
  hemina, o pigmento do nosso sangue e bile, é o Fe
  o átomo complexado no anel porfirínico.
• As cadeias laterais esterificadas podem ser
  álcoois de cadeia longa como o fitol no caso da
  clorofila.

10

• Esta descoberta levou Treibs acertadamente a
  propor a origem biológica para o petróleo e que
  os compostos precursores do petróleo não poderiam
  ter sido submetidos a temperaturas muito altas,
  pois senão as porfirinas teriam sido
  completamente destruídas.
• Isto significa que algumas moléculas orgânicas
  complexas podem sobreviver milhões de anos dentro
  de rochas ou sedimentos.

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Marcadores Orgânicos em Geoquímica fósseis
químicos

• Devido a eficiência da remineralização da matéria
  orgânica ,poucas moléculas conservam sua
  estrutura inteira intacta ou mesmo seu esqueleto
  carbônico original. Assim compostos orgânicos que
  resistem a destruição parcial das suas estruturas
  originais pelo processos biogeoquímicos foram
  chamados de
• Fósseis Quimicos por Eglinton(1967).

12

• Após o trabalho pioneiro de Treibs com as
  porfirinas , a identificação de novos marcadores
  na década de 60 foi possível graças à
  cromatografia em fase gasosa. Esta técnica
  permite a separação de misturas complexas de
  compostos orgânicos em matrizes naturais.
• O acoplamento da cromatografia de gás à
  espectrometria de massa nos anos 70, facilitou
  mais ainda identificação de inúmeros novos
  marcadores moleculares.

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Métodos de resolução de substâncias em uma mistura
14
Gas Chromatograph
Injection Port
Detector
Capillary Column
Data System or Recorder
Carrier Gas Supply
Oven
15
(No Transcript)
16
(No Transcript)
17
(No Transcript)
18
Gas Chromatography
Gas Chromatograph
Sample mixture of volatile liquids (1?L)
Gas Chromatogram
B
E
C
A
Abundance
D
0
5
10
15
20
Time (minutes)
19
Cromatografia com DIC ou com Espectroscopia de
Massa

• No caso de detectores como o de ionização de
  chama a identificação é feita com base no tempo
  de retenção do pico , comparado com o de padrões
  comerciais ou sintetizados no próprio
  laboratório. Assim precisamos de um número enorme
  de padrões que são de alto custo ou investir
  tempo nas sínteses
• Já com acoplamento CG-EM a identificação é feita
  pela razão massa/ carga do íon comparada com as
  M/z s de uma biblioteca de espectros.

20
Mass Spectrometer
Sample Introduction
Data Output
Inlet
Data System
Ion Source
Mass Analyzer
Ion Detector
Vacuum Pumps
21
Electron Impact Ionization Source
70 Volts
Electron Collector (Trap)
Positive Ions

Inlet
Neutral Molecules
_
_
Repeller
to Analyzer







e-
e-
e-
_
Electrons
Extraction Plate
Filament
22
Magnetic Sector Mass Analyzer
ion trajectory in register
ion trajectory not in register (too light)
S
Detector
Ion Source
N
ion trajectory not in register (too heavy)
Electromagnet
23
Quadrupole Ion Filter
resonant ion
non-resonant ion
_
Detector


_
Ion Source
DC and AC Voltages
24
Mass Spectrometer
Sample Introduction
Data Output
Inlet
Data System
Ion Source
Mass Analyzer
Ion Detector
Vacuum Pumps
25
Mass Spectrometry
O
C
H
3
Mass Spectrometer
C
N
C
H
3
C
N
C
H
C
C
N
N
O
H
Typical sample isolated compound (1 nanogram)
194
Mass Spectrum
67
109
Abundance
55
82
42
136
165
94
40
60
80
100
120
140
160
200
180
Mass (amu)
26
(No Transcript)
27
Uso de marcadores moleculares como traçadores de
origem

• Em 1967 Eglington passou a usar hidrocarbonetos
  encontrados em sedimentos marinhos ou organismos
  como traçadores de origem do material
• Uma das primeiras aplicações foi no estudo da
  contaminação por petróleo de organismos e
  sedimentos. Pela distribuição dos alcanos
  (parafinas) é possível determinar a origem
  destes compostos.

28
Hidrocarbonetos como traçadores

• Hidrocarbonetos biogênicos ou seja os naturais,
  apresentam predominânica de parafinas com número
  par de átomos de carbonos no seu esqueleto. Já
  os hidrocarbonetos de petróleo, ou seja de origem
  antropogênica, apresentam uma distribuição
  equitativa de hidrocarbonetos de número par e
  impar de carbonos.

29
Amostra de sedimento com n-alcanos naturais
30

Amostra de petróleo da Baía de Todos os Santos
31
Cromatograma de uma amostra de sedimento com UCM
32

• A análise dos hidrocarbonetos polinucleares
  aromáticos(HPAs) de uma amostra ambiental também
  auxilia na identificação da sua origem . Pela
  distribuição relativa dos HPAs não alquilados e
  alquilados no cromatograma ou no EM dá para
  saber se estes compostos vieram da combustão de
  biomassa, carvão ou de derivados do petróleo.
• O Laboratório de Química Orgânica Marinha do
  IOUSP utiliza em rotina os marcadores
  moleculares como traçadores de origem.

33
(No Transcript)
34
Razões isotópicas acoplada a CG-MS

• Com o acoplamento da cromatografia de gás
  simultaneamente a determinação das razões
  isotópicas numa só injeção, como é o caso do
  equipamento IRCGMS que foi mostrado a vocês no
  laboratório da Geoquímica Marinha, fica ainda
  mais facilitada a identificação da origem do
  material se marinho ou terrestre ou mista.

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Definição atual de Marcador Molecular

• Uma molécula orgânica cujo esqueleto carbônico
  pode ser ligado inequivocamente à um precursor
  biológico definido
• Algumas moléculas sómente são produzidas por
  certas espécies ou classes de organismos , assim
  sendo sua ocorrência pode ser associada a
  existência prévia destes organismos naquele
  ambiente.

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Áreas de aplicação dos marcadores moleculares

• Exploração de petróleo e gás
• Paleoceanografia
• Exploração da biosfera, origem da vida
• Arqueologia
• Estudos microbiológicos
• Exobiologia

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Requisitos para uso de marcadores moleculares

• Os compostos devem ser possíveis de serem
  determinados quantitativamente em matrizes
  naturais complexas fornecendo
• -Identificação das estruturas moleculares
• -Composição isotópica
• -Origem biológica claramente associada a um
  grupo de organismos.

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Requisitos para marcadores moleculares

• Isso implica num o esqueleto carbônico bem
  definido e com características próprias devido a
  especificidade do processo biossíntético.
• Blocos de Construção bem definidos
• Exemplo é sequência isoprênica CC-CC
• 
  C Isopreno é elemento básico de construção
  de vários compostos com 10,15 ou 20 Cs.São os
  terpenos( do Grego terebinthos, Portugues.
  terebentina). No ambiente marinho o esqualeno é
  um exemplo de terpenóide sendo o precursor do
  colesterol.

39
Diterpenos importantes na ambiente marinho

• Phytol derivado da clorofila

40
(No Transcript)
41
(No Transcript)
42
Paleo-oceanografia Clássica

• Antes do uso generalizado de marcadores
  moleculares a forma clássica de avaliar a
  contribuição sedimentar para os ambientes
  atuais, era o estudo dos fósseis marinhos,
  visíveis pela microscopia como restos de
  esqueletos calcáreos ou silicosos. Posteriormente
  passou-se a usar as razões isotópicas de C 13,
  N15 e O16 eO18 nestas carapaças.

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Estratigrafia química Químiotaxonomia
Paleoceanografia

• O exemplo clássico são os esqueletos de
  foraminíferos marinhos.
• Ocorre que nem sempre os sedimentos
• mais antigos preservaram estes restos de
  organismos.
• Em contraste os lipídeos são bem preservados
  fazendo parte da constituição bioquímica
  original do

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Requisitos de Biomarcadores

• organismo. Os hidrocarbonetos em geral, ácidos
  graxos e alcooís superiores são bem preservados
  nos sedimentos marinhos e nas rochas geradoras de
  óleo. Deste modo na prática são os marcadores
  moleculares mais utilizados em rotina.

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Características dos Biomarcadores

• .Mas isto não significa que qualquer lipídeo ou
  hidrocarboneto sirva como marcador ideal. O
  marcador não precisa conservar todos seus grupos
  funcionais originais como COOH, OH, NH2, etc
  durante os processos de diagenese, metagenese
  mas precisa conservar seu esqueleto principal.

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Alterações da estrutura original dos marcadores
moleculares

• Durante a diagênese nos sedimentos os marcadores
  sofrem as mesmas reações que os outros orgânicos
  do sedimento
• Perda dos grupos funcionais
• Aromatização( perda de Hs)
• Isomerização
• A diferença é que o esqueleto carbônico básico é
  conservado

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Paleo-oceanografia Clássica

• Tradicionalmente a relação O18O16 do restos de
  fósseis de invertebrados marinhos
• ( testas carbonáceas), encontrados no sedimentos
  tem sido usada na determinção das
  paleotemperaturas dos oceanos, mas a extensão das
  glaciações, o balanço da evaporação e
  precipitação, a profundidade. de compensação do
  carbonato e a diagênese afetam a exatidão destas
  determinações

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Marcadores moleculares e a paleotemperatura dos
oceanos

• Tradicionalmente os marcadores moleculares são
  muito utilizados pela industria de petróleo para
  caracterizar os diversos tipos de óleo e sua
  maturidade. Uma nova e fascinante aplicação dos
  marcadores moleculares é nos estudos da
  paleotemperatura dos oceanos

49
Uso das alquenonas

• Uma alternativa ao uso das testas de fosséis e
  a relação O16/O18 é usar um marcador molecular.
  As alquenonas são cetonas insaturadas de cadeia
  longa, C37-C39, presentes em algas halofitas,
  como a Emiliana huxleyi.

50
Emiliana huxleyi

• Esta alga é ubíqua em todos oceanos e suas
  assinaturas moleculares estão presentes em
  praticamente todos sedimentos marinhos e
  lacustres, registrando assim as variações dos
  blooms de fitoplâncton que ocorreram no passado
  geológico.

51
(No Transcript)
52
Ocorrência das alquenonas

• A maior fonte das alquenonas é o cocólitoforito
  Emiliana Huxley Estudos com culturas destas
  algas mostraram que o número de duplas ligações
  era função da temperatura de cultivo.
• O grau de insaturação, isto é o, número de duplas
  ligações entre os Cs , das alquenonas encontradas
  nos sedimentos, esta associada as quedas de
  temperatura ocorridas nos oceanos no passado.
  Aumentando as duplas ligações diminui o ponto de
  fusão destes lipídeos permitindo a sobrevivência
  desta alga em temperaturas mais baixas.

53

• Isto porque são os lipídeos é que garantem a
  fluidez celular. As alquenonas resistem bem aos
  processos diagenéticos, sendo os lipideos mais
  estáveis que conhecemos
• Para calibração do método é usada a relação das
  alquenonas C 372 e C 373. Esta notação
  refere-se a posição das duplas ligações

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Aplicações dos marcadores moleculares no
Atlântico Sul

• Tese de Livre Docência da Prof.a Márcia Caruso
  Bícego em 2007 IOUSP
• Reconstrução paleoceanográfica dos últimos 7500
  anos na plataforma continental do Atlântico
  Sudoeste baseada em marcadores geoquímicos
  orgânicos

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• Tese de Doutorado de Rafael Lourenço 2007 IOUSP
• Aplicação de marcadores orgânicos moleculares
  em estudos oceanográficos e paleoceanográficos
  Estudo de caso na Margem Continental Superior do
  Sudeste do Brasil 142p

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• Em ambos trabalhos foram usados os
  hidrocarbonetos, alquenonas, esteróis, ácidos
  graxos e álcoois superiores como marcadores
  moleculares nos testemunhos de sedimentos. Foi
  possível inferir claramente mudanças de
  temperatura e de produção primária no período de
  alguns milhares de anos com estes marcadores.

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Lipídeos como Marcadores Metodologia Analítica

• Os lipídeos na coluna de água, sedimentos ou
  organismos estão na forma livre ou químicamente
  ligados. Dependendo do tipo de estudo é
  necessária um extração diferenciada dos dois da
  matriz original.
• A extração simples com um único solvente remove
  os lipídeos livres.

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Definição de Lipídeos

• Lipídeos são todas substâncias produzidas por
  organismos, que são praticamente insolúveis em
  água, mas facilmente solúveis em em solventes de
  gorduras tais como clorofórmio, tetracloreto de
  carbono, éteres, hidrocarbonetos alifático e
  aromáticos e acetona apud Bergmann, 1963
• A definição é OPERACIONAL não definindo classe
  pelos grupos funcionais

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Lípideos saponificáveis e insaponificáveis

• Os Ácidos Graxos e seus ésteres (Gorduras) são
  solubilizados pela saponificação em meio alcalino
  forte.
• Já Alcoois, Esteroídes e hidrocarbonetos não são
  afetados pelos alcalis
• Já na extração da matriz original(sed/org)
  podemos usar esta diferença para uma separação
  prévia por tipos .

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Lipídeos Polares e Apolares

• Apolares ou neutrosCêras, ésteres de ácidos
  carboxílicos( gorduras),esteróis hidrocarbonetos.
• Polares Principalmente fosfolipídeos mas
  também inclui as lipoproteínas, carotenóides,
  pigmentos da clorofila.

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Papel Biológico dos Lipideos Neutros e Polares

• Os polares constituem os principais componentes
  das membranas celulares dos seres vivos, servindo
  ainda de agentes de transmissão e recepção
  nervosa.
• Os neutros tem como função principal estocar
  energia nos organimos.
• Os lipídeos estão entre os compostos orgânicos
  mais abundantes dos organismos.

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(No Transcript)
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Estruturas químicas do lípideos usados como
marcadores

• Extremamente diversificadas
• Hidrocarbonetos simples
• Ácidos graxos livres
• Álcoois superiores
• Terpenóides
• Esteróis
• Hopanos

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Etapas do procedimento analítico

• Extração
• Purificação dos extratos Clean Up
• Derivatização(Opcional).
• Analise final por cromatografia de gás com
  Detector de Ionização de Chama ou acoplada a
  Espectrometria de Massas

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(No Transcript)
66
(No Transcript)
67
(No Transcript)
68
Lipídeos predominantes em matrizes biológicas

• São os hidrocarbonetos e ácidos graxos
• No Fito e Zooplâncton marinhos
• Ácido Graxo predominante é o n-C16
• Hidrocarbonetos n-C17 e n-C18
• Nas Plantas Terrestres Superiores temos
• ácidos graxos pares de maior PM como n-C28, C30 e
  C32. Já nas cêras cuticulares
• hidrocarbonetos ímpares n- C27, C29 e C31

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(No Transcript)
70
Unidades básicas de esqueletos de C dos lípideos
marcadores

• Os lipídeos marcadores apresentam dois tipos
  principais de cadeias
• C
• Poli-isoprenos (CC-C-C) n
• Poliquetídeos

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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Lipídeo de plantas terrestres
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