Estudio de procesos dinamicos por RMN

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• Estudio de procesos dinamicos por RMN
• Hasta ahora hemos hablado de experimentos y
  tecnicas de
• RMN para estudiar molecular congeladas. No
  hemos hecho
• mencion de la escala de tiempos de las medidas
  de RMN.
• Que pasa cuando algo de los que tenemos en el
  tubo esta
• sujeto a algun tipo de proceso dinamico? Esto
  puede ser una
• reaccion quimica, un equilibrio conformacional,
  intercambio
• de un molecula entre el estado libre y ligado
  en un complejo
• de proteina/ligando, etc., etc

Kex
Equilibrio Conformacional
Equilibrio Quimico
KB
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• Medida de constantes de velocidad
• Digamos que el proceso que estamos analizando es
  la
• inversion de la N,N-dimetilformamida (DMF)
• Sabemos que los metilos rojo y azul van a
  intercambiar
• sitios relativamente lento debido al caracter
  de doble enlace
• de la amida. Los dos metilos son quimica y
  magneticamente
• diferentes, y un espectro RMN de la DMF da una
  señal para
• cada metilo

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1 Intercambio (s) gtgt o
dr - da
Dd
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• Constantes de velocidad (continuado)
• Ahora empezamos a calentar la muestra. Como la
  velocidad
• de la inversion depende de su DG y este esta
  afectado por
• T, temperaturas mas altas hacen que las cosas
  vayan mas
• rapido. Vemos lo siguiente
• A cierta temepratura, llamada la temperatura de

T
TC
1
1 Intercambio (s) o
dr - da
Dd
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• Constantes de velocidad (mas...)
• Vemos que hay dos regiones a medida que variamos
  la
• temperatura, llamdas de intercambio rapido y
  lento
• Como podemos estimar la temperatura de la
  transicion (la
• temperatura de coalecenscia), podemos sacar
  datos acerca
• de la termodinamica y la cinetica del proceso.
• Si hiciecemos un estudio detallado, veriamos que
  tenemos
• que tomar en cuanta las poblaciones de los dos
  sitios (uno
• puede estar mas favorecido que el otro
  energeticamente),

Dd velocidad gt 1 Intercambio lento Dd
velocidad 1 Transicion (TC) Dd velocidad lt 1
Intercambio rapido
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• Constantes de velocidad (...y mas)
• A partir de Dd (en Hz) en el limite de
  intercambio lento
• calculamos la constante de intercambio a la
  temperatura de
• coalecenscia
• Usamos frecuencias en radianes y por eso es que
  aparece
• el factor de p. Esta ecuacion tiene muchas
  simplificaciones
• (nunca sabremos si la temperatura mas baja a la
  que hicimos
• el experimento es realmente intercambio lento,
  y no
• consideramos los anchos de linea).
• De cualquier manera, funciona bastante bien. Con
  la

Kex p Dn / v2 2.22 Dn
DG R TC 22.96 ln ( TC / Dn )
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• Ejemplo de equilibrio conformacional
• Como parte de mi trabajo con taxol, trate de
  preparar una
• analogo de la cadena lateral rigido para
  evaluar si el imponer
• rigidez mejoraba o empeoraba la actividad
  biologica.
• Decidi hacer un sistema bifenilo, que a la larga
  demonstro
• ser una muy mala idea. Si hubiese leido un poco
  hubiese
• sabido que estas cosas se comportan medio
  raro....
• Considerado que tengo 10 pulgares, hacerlo fue
  todo un
• logro (me llevo muuuuucho tiempo). Al tomar un
  1H, vi que
• al parecer tenia dos cosas en solucion

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• Equilibrio conformacional (continuado)
• Como me habia matado por 4 meses haciendo esto,
  no lo
• iba a dejar por eso. Tambien, tener dos
  conformeros no era
• bueno para probar nada. Si esto era un
  equilibrio, un cambio
• en temperatura tenia que afectar las
  velocidades de
• intercambio

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• Equilibrio conformacional (mas)
• En este caso, la inversion de los anillos no
  ocurre sola, y
• hay otros cambios conformacionales asociados.
  Tambien
• puede haber puentes-H formandose/rompiendose,
  asi que
• es dificil elegir dos señales para hacer los
  calculos de la
• barrera de energia de inversion.
• Si elejimos un par de picos aromaticos (los
  anillos son los
• se que invierten), medimos un dn de 0.04 ppm (o
  20 Hz a
• 500 MHz)

20 Hz
Kex 44.4 s-1 DG 18.5 Kcal/mol
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• Conformacion de ligandos - TRNOE
• Una de las cosas mas importantes en el diseño de
  drogas
• es averiguar como se ligan a su receptor, Que
  generalmente
• es una proteina o ADN.
• Con esta informacion e informacion de las REA
  podemos
• preparar analogos que no solo tengan los
  requerimientos
• quimicos para ser activos, pero tambien los
  requerimientos
• conformacionales impuestos por el sitio activo.
• Una forma es estudiar la conformacion de la
  molecula aislada
• (por rayos-X o RMN), y asumir que va a tener la
  misma
• cononformacion en el sitio activo.
• En moleculas flexibles (el 99.9 de los casos),
  el cambio
• en el entorno (polaridad, grupos no-polares,
  puentes-H, etc.)
• al pasar del agua al sitio activo va a afectar
  la conformacion.

Libre
Ligado
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• Conformacion de ligandos (continuado)
• Dependiendo del tamaño del receptor podemos
  determinar
• la estructura del complejo y usar eso (rayos-X,
  RMN).
• Esto consume muchisimo tiempo, y vamos a estar
• determinando, principalmente, la estructura del
  receptor.
• Lo que queremos es saber la conformacion del
  ligando...
• Ademas, la mayoria de los receptores son enormes
  (de 100
• a 200 KDa), y los interesantes estan en
  membranas, osea
• que no les podemos (podiamos?) entrar con
  nada.
• Lo que, en algunos casos, nos salva son las
  diferencias
• relativas entre la velocidad de crecimiento del
  NOE para
• protones del ligando (la velocidad de
  crecimiento de la
• relajacion cruzada) y las constantes de
  asociacion entre el
• ligando y el receptor.

HI

HS

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• Conformacion de ligandos (mas)
• Supongamos que el ligando se disocia y vuelve a
  la solucion
• Va a adoptar su conformacion en solucion
  rapidisimo
• Generalmente, koff (o la constante de
  disociacion) es mucho
• mas lenta que kunf (la velocidad a la que el
  ligando sufre
• unfolding), osea que solo nos preocupamos por
  koff.
• Definimos todas las constantes de la siguiente
  forma

HI

H
HI


kunf
koff kon
H
HS



HS
kon ligando-receptor K
koff receptor ligando
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• Conformacion de ligandos (y mas)
• Esto significa que si el proceso de
  asociacion/disociacion es
• rapido comparado con T1, el NOE que surgio
  entre los 1Hs
• cuando el ligando estaba en el sitio activo va
  a persistir luego
• de que el ligando se disocie y adopte su
  conformacion en
• solucion Porque?
• Tenemos que considerar todo el proceso

Kon koff
RIF
RIB
IF IB SF SB
sISF
sISB
Kon koff
RSF
RSB
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• Conformacion de ligandos (y mas...)
• Es mas, si tenemos buen intercambio (turnover)
• comparado con el tiempo de relajacion T1, vamos
  a tener
• varios ligandos interactuando con el mismo
  receptor antes de
• que el NOE del primero decaiga.
• Osea, podemos hacer el experimento con un exceso
  de
• ligando (i.e., 10 veces mas), y las señales del
  ligando van a
• ser mas grandes que las del receptor (que van a
  ser anchas
• y van a aparecer todas superpuestas...).
• Otra cosa buena de medir NOEs de ligandos en el
  sitio
• activo por TRNOE es que como vamos a estar
  mirando al
• ligando en solucion, sus señales van a estar
  bien definidas
• (anchos de linea relativamente chicos)

L ligado
L libre
proteina
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• Conformacion de ligandos (y mas)
• Si parece demasiado bueno para ser verdad, es
  demasiado
• bueno para ser verdad. Para poder usar TRNOE se
  tienen
• que dar un monton de cosas (todas juntas)
• El ligando no puede interactuar mucho con el
  receptor,
• ya que necesitamos intercambio constante entre
  los
• ligandos libres y los ligandos en el sitio
  activo.
• La constante Koff tiene que ser mucho mas chica
  que
• el tiempo de relajacion T1, sino el NOE
  desaparece
• antes de que lo podamos detectar.
• En la practica, esto limita mucho el tipo de
  sistemas que
• podemos analizar usando esta tecnica...

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• Gradientes de campo magnetico y difusion
• Todo lo que hemos visto sucede en campos
  magneticos
• perfectos (i.e., Bo homogeneos). Esto lo
  necesitamos para
• tener buena resolucion/sensibilidad. Sin
  embargo, crear un
• gradiente con caracteristicas conocidas en Bo
  es muy util.
• Un gradiente de campo resulta en diferentes Bs.
  Si solo
• consideramos una variacion linear en el eje z
  (i.e., un
• gradiente-z, o Gz) y una muestra de agua,
  veremos que las
• moleculas de agua con distintas zs tendran
  diferentes ?s
• (porque ? ? ???Bo Gz))

Bo
Bo Gz
?
?
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• Gradientes de campo magnetico (continuado)
• Y esto es util? Para empezar, podemos generar
  una imagen
• de la muestra si aplicamos un gradiente durante
  la
• adquisicion de datos. Como los espines en
  distintos lugares
• del tubo tienen distintos ?s, obtenemos un
  espectro continuo
• que refleja la forma del contenedor.
• Osea, un gradiente de campo linear deja a los
  espines

w (Hz)
Bo Gz
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• Gradientes y difusion
• Y esto deriva en medidas de difusion. Medir el
  coeficiente
• de difusion (D) es muy importante en
  quimica/biologia.
• Reporta sobre mobilidad de moleculas,
  interacciones
• intramoleculares, etc., etc.
• La espectroscopia de gradientes de campo
  pulsados es ideal
• para medir la difusion de particulas con
  nucleos que poseen
• RMN. La tecnica mas basica implica combinar un
  eco de
• espin con dos gradientes de signo opuesto y
  largo d
• separados un tiempo D

180y
90y
y
D/2
D/2
1H
D
Canal de gradientes
d
d
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• Gradientes y difusion (continuado)
• Para un espin que se mueve poco (luego del pulso
  p / 2)

y
y
G(d)
180 D/2
x
x
y
y
-G(d) D/2
x
x
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• Gradientes y difusion (continuado)

y
y
G(d)
180 D/2
x
x
y
y
-G(d) D/2
x
x
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• Gradientes y difusion (continuado)
• Para calcular el valor de D, repetimos el
  experimento con
• muchos valores de G manteniendo d y D
  constantes.
• La variación de intensidad contra gradiente que
  se obiente
• guarda la siguiente relacion, y un regresion
  nos da el D.
• Datos reales para el EmimOAc a 40 oC