Recherche et dosage des amphtaminiques

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Le département Toxicologie de lIRCGN est
régulièrement requis pour des confirmations de
dépistages urinaires positifs réalisés par les
forces de gendarmerie ou de police, ou pour la
recherche de stupéfiants chez les conducteurs
impliqués dans les accidents corporels de la
circulation. Lévolution des exigences légales
liée à la sécurité routière (arrêté du 5
septembre 2001) et des exigences de qualité nous
a amenés à réévaluer nos méthodes de recherche et
de dosage des stupéfiants dans le sang. Depuis
2002, notre stratégie de validation sest
largement inspirée des articles publiés dans STP
PHARMA PRATIQUES. Forts de ces quelques années
dexpérience, nous avons décidé dévaluer, selon
ce principe novateur (détermination du profil
dexactitude), nos méthodes de recherche et de
dosage des stupéfiants dans le sang. Le plan de
validation a nécessité des dosages répétés quatre
fois, en conditions de routine, de quatre sangs
surchargés de chacune des molécules dintérêt par
trois personnes du laboratoire (soit 3 séries de
4 niveaux à 4 répétitions avec leur gamme
respective). Ce plan concilie les exigences de ce
type de validation aux contraintes matérielles,
pécuniaires et temporelles. Les résultats ont
été, dans un premier temps, exploités selon des
feuilles de calcul développées au laboratoire
puis, plus récemment, selon le logiciel e-noval
v1.1. Les profils dexactitude et de risque sont
issus de ce dernier.
Validation de méthodes analytiques Recherche
et dosage des stupéfiants dans le sangdans le
cadre de la sécurité routièreO. ROUSSEL, S.
HERVE, P. HERARD, O.MESSINES, M. PERRIN

• Recherche et dosage des amphétaminiques
• La prise dessai d1 mL déchantillon
  additionnée des étalons deutérés, est extraite à
  laide dun Toxitube A. La phase organique est
  évaporée à sec, le résidu est solvaté puis dérivé
  à lanhydride heptafluorobutyrique. 1 µL de la
  solution dérivée obtenu est analysé en CPG/SM. Le
  chromatographe employé est un SHIMADZU GC-17A /
  QP 5000, les composants sont élués dans une
  colonne JWS Ultra-1 (12m x 0,2mm x 0,33 µm),
  lacquisition se réalise en mode SIM (single ion
  monitoring). Les résultats (et non les signaux !)
  déterminés par le logiciel dexploitation du
  chromatographe sont directement exploités.
• Exemple de la MDMA
• Mesure à 210 m/z
• Étalon deutéré à 213 m/z
• Le profil dexactitude traduitgraphiquement
  lincertitudede mesure déterminée lorsde la
  validation.
• Ces incertitudes sont calculéesselon le principe
  de lerreur totale.
• La limite inférieure de quantification a été
  déterminée à 19,85 ng/mL, la supérieure à été
  déterminée à 454,6 ng/mL. La limite de détection
  a été estimée à 7 ng/mL.
• Les amphétaminiques recherchés et dosés avec
  cette méthode validée sont lamphétamine, la
  méthamphétamine, la MDMA, la MDA, la MDEA et le
  MBDB.
• Recherche et dosage des cannabinoïdes
• Une prise dessai de 2 mL déchantillon
  additionnée des étalons deutérés, est extraite
  après acidification par lacide acétique à laide
  dun mélange hexane/acétate déthyle. La phase
  organique est évaporée à sec, le résidu est
  solvaté puis dérivé au bis-triméthylsilyl-trifluor
  o-acétamide. 2 µL de la solution dérivée obtenue
  sont analysés en CPG/SM selon des conditions
  similaires à la méthode précédente.
• Exemple du THC
• Mesure à 386 m/z
• Étalon deutéré à 389 m/z

• Recherche et dosage des opiacés et des
  cocaïniques
• Une prise dessai d1 mL déchantillon
  additionnée des étalons deutérés, est extraite à
  pH 9 par un mélange de chloroforme et
  disopropanol. Lextrait obtenu est
  contre-extrait par de lacide chlorhydrique. La
  phase acide est neutralisée, tamponnée à pH 9
  puis extraite par le mélange de chloroforme et
  disopropanol. La phase organique est évaporée à
  sec, le résidu est solvaté puis dérivé au
  bis-triméthylsilyl-trifluoro-acétamide. 1 µL de
  la solution dérivée obtenue est analysé en CPG/SM
  selon des conditions similaires aux méthodes
  précédentes.
• Exemple de la 6-MAM
• Mesure à 399 m/z
• Étalon deutéré à 402 m/z
• Exemple de la BZE
• Mesure à 361 m/z
• Étalon deutéré à 364 m/z

Conclusion Lors de la phase de validation, la
mise en uvre des méthodes sous leur forme finale
(protocole de routine) a simplifié la
compréhension du processus de validation aux
opérateurs moins investis, tout en nous assurant
des performances de ces méthodes au quotidien.
Ainsi les graphiques obtenus nous informent
directement et simplement de lincertitude de
mesure et des limites de quantification. La mise
en uvre de ce protocole a, par ailleurs, été
simplifiée par lemploi de feuilles de calcul
préétablies puis par celui dun logiciel dédié.
Finalement, lévaluation de nos méthodes de
recherche et de dosage des principales substances
stupéfiantes, selon le protocole décrit, a
confirmé les qualités de celles-ci à répondre aux
exigences de larrêté du 5 septembre 2001 ainsi
quà celle que nous nous sommes fixée, à savoir
incertitude de mesure inférieure à 40 (exception
des cannabinoïdes à 50).
Bibliographie Groupe de travail ACCREDITATION
de la SFTA   Aide à la validation des méthodes
en toxicologie et suivi thérapeutique
pharmacologique , A.T.A., XVII (3), supplément
1. Commission SFSTP. Validation des procédures
analytiques quantitatives. Harmonisation des
méthodes , S.T.P. Pharm. Prat.., 2003, 13 (3)
101-38. Commission SFSTP. Guide de validation
des méthodes de dosage biologique , S.T.P.
Pharm. Prat., 2002, 12 (6),317-36 Commission
SFSTP. Méthodes chromatographiques de dosage
dans les milieux biologiques stratégie de
validation , S.T.P. Pharm. Prat., 1997, 7 (3)
169-94. Molinaro R. et al.  Analyse simultanée
des principaux stupéfiants et métabolites dans le
sang total , TOXICORAMA, 1997, IX (3),
183-96 Kintz P. et al.  Identification et dosage
des cannabinoïdes dans le sang , TOXICORAMA,
1996, VIII (2), 29-33. Commission SFSTP. Guide
de validation analytique , STP Pharm. Prat.,
1992, 2 (4), 205-26.