PRACTICA 1:

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PRACTICA 1

• Método de cuenta total estándar de
  microorganismos mesófilos aerobios en alimentos y
  método del numero mas probable para el análisis
  de coliformes fecales en alimentos.
• Mauricio Sánchez Lecuona
• Zamora Núñez Francisco
• Omar Flores
• Sandra Mejia

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PROCEDIMIENTO

• 1. Pesar 10 g de alimento (en condiciones
  asépticas), añadir 90 ml de solución salina y
  licuar por un minuto ( alimentos sólidos)
• 2. Pesar 10 g de alimento (en condiciones
  asépticas), añadir 90 ml de solución salina y
  licuar por un minuto ( alimentos semi-sólidos o
  líquidos)

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• 3. Seguir haciendo diluciones colocando 1 ml de
  la solución anterior con 9 ml de solución salina
  sucesivamente (10-2, 10-3, etc.)
• 4. Inocular 0.1 ml de cada dilución sobre placas
  de Agar cuenta estándar e incubar.
• 5. Posteriormente, inoclurar una serie de tres
  tubos con 10 ml de caldo lauril y 1 ml de
  solución correspondiente a las tres primeras
  diluciones hechas anteriormente. Dejar incubar y
  observar resultados.

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• 6. De los tubos anteriores, observar los que dan
  positivos en la prueba de caldo Lauril y pasar de
  dos a tres asadas de cultivos con 10 ml de Caldo
  EC. Dejar incubar.
• 7. Sembrar dos placas de medio EMB y RVB apartir
  de los tubos positivos con medio EC.

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• 8. Seleccionar colonias de las placas de medio
  EMB y RBV y sembrarlas en Agar SIM, Agar Citrato
  de Simmons y Caldo RM-VP
• 9. Realizar la prueba de Indol con el reactivo
  de Kovac para el Agar Sim y la de
  Vogues-Proskauer para el Caldo RM-VP. Observar
  los resultados.

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Agar cuenta estándar(Agar triptona-extracto de
levadura)

• Este medio de cultivo es el de uso mas
  generalizado.
• Se utiliza principalmente para el aislamiento e
  identificación y cuenta de coliformes

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CALDO LAURIL SULFATO

• Medio selectivo recomendado para la detección y
  recuento de coniformes en aguas, aguas residuales
  y alimentos.
• Considerar como positivos aquellos tubos que
  presentan gas.

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CALDO LAURIL SULFATO
Fórmula (en gramos por litro) Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
  Triptosa 20.0 Suspender 35,6 g del polvo en 1 litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta la disolución total. Distribuir en tubos conteniendo tubos de fermentación. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C.
Lactosa 5.0 Suspender 35,6 g del polvo en 1 litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta la disolución total. Distribuir en tubos conteniendo tubos de fermentación. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C.
Cloruro de sodio 5.0 Suspender 35,6 g del polvo en 1 litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta la disolución total. Distribuir en tubos conteniendo tubos de fermentación. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C.
  Lauril sulfato de sodio 0.1 Suspender 35,6 g del polvo en 1 litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta la disolución total. Distribuir en tubos conteniendo tubos de fermentación. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C.
  Fosfato dipotásico 2.75 Suspender 35,6 g del polvo en 1 litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta la disolución total. Distribuir en tubos conteniendo tubos de fermentación. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C.
  Fosfato monopotásico 2.75 Suspender 35,6 g del polvo en 1 litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta la disolución total. Distribuir en tubos conteniendo tubos de fermentación. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C.
pH final 6.8 0.2 pH final 6.8 0.2 pH final 6.8 0.2
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Caldo EC

• Medio de cultivo para coliformes y E.coli en
  aguas, alimentos y otros materiales.
• La lactosa es la fuente de energía para los
  microorganismos, especialmente coliformes y
  E.coli con producción de gas. Las sales biliares
  inhiben el crecimiento de Gram.-positivos. La
  peptona de caseína proporciona los nutrientes
  necesarios para el desarrollo de las bacterias y
  el cloruro de sodio mantiene el equilibrio
  osmótico.
• Se consideran resultados positivos el crecimiento
  bacteriano y producción de gas.

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AGAR EMB (EOSINA AZUL DE METILENO)

• Es un medio selectivo y diferencial, adecuado
  para el crecimiento de enteró bacterias.
• La combinación utilizada de eosina y azul de
  metileno, inhibe el desarrollo de microorganismos
  Gram. positivos y de bacterias Gram. negativas y
  también, permite diferenciar bacterias
  fermentadoras y no fermentadoras de lactosa.
• Los microorganismos fermentadores de lactosa,
  originan colonias de color azulado-negro, con
  brillo metálico. Las colonias producidas por
  microorganismos no fermentadores de lactosa son
  incoloras.

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Fórmula (en gramos por litro)

• Peptona10.0
• Lactosa10.0
• Fosfato dipotásico2.0
• Agar15.0
• Eosina0.4
• Azul de metileno0.065

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EMB ()
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AGAR ROJO NEUTRO-CRISTAL VIOLETA-BILIS RVB

• Agar selectivo propuesto por DAVIS (1951) para la
  detección y la enumeración de las bacterias del
  coliform incluyendo E. coli en agua, leche,
  helado, carne y otros comestibles.
• Medio de color púrpura-rojizo

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AGAR RVB
Fórmula (en gramos por litro) Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Extracto de levadura 3.0 Suspender 41,5 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar, calentando a ebullición 1 o 2 minutos. Enfriar a 45C y verter en placas. Una vez preparado debe usarse de inmediato. NO AUTOCLAVAR.
  Peptona 7.0 Suspender 41,5 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar, calentando a ebullición 1 o 2 minutos. Enfriar a 45C y verter en placas. Una vez preparado debe usarse de inmediato. NO AUTOCLAVAR.
Sales biliares 1.5 Suspender 41,5 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar, calentando a ebullición 1 o 2 minutos. Enfriar a 45C y verter en placas. Una vez preparado debe usarse de inmediato. NO AUTOCLAVAR.
Lactosa 10.0 Suspender 41,5 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar, calentando a ebullición 1 o 2 minutos. Enfriar a 45C y verter en placas. Una vez preparado debe usarse de inmediato. NO AUTOCLAVAR.
Cloruro de sodio 5.0 Suspender 41,5 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar, calentando a ebullición 1 o 2 minutos. Enfriar a 45C y verter en placas. Una vez preparado debe usarse de inmediato. NO AUTOCLAVAR.
  Agar 15.0 Suspender 41,5 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar, calentando a ebullición 1 o 2 minutos. Enfriar a 45C y verter en placas. Una vez preparado debe usarse de inmediato. NO AUTOCLAVAR.
  Rojo neutro 0.03 Suspender 41,5 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar, calentando a ebullición 1 o 2 minutos. Enfriar a 45C y verter en placas. Una vez preparado debe usarse de inmediato. NO AUTOCLAVAR.
Cristal violeta 0.002 Suspender 41,5 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar, calentando a ebullición 1 o 2 minutos. Enfriar a 45C y verter en placas. Una vez preparado debe usarse de inmediato. NO AUTOCLAVAR.
pH final 7.4 0.2 pH final 7.4 0.2 pH final 7.4 0.2
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RESULTADOS
Microorganismos Colonias
Enterobacterias fermentadoras de lactosa Rojas, de 1 a 2 mm de diámetro, con halo de precipitación rojizo
Enterobacterias no fermentadoras de lactosa Incoloras
Enterococcus spp. Rosadas como punta de alfiler (puntiformes)
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AGAR SULFURO INDOL MOVILIDAD SIM

• Es un medio semisólido destinado a verificar la
  movilidad, producción de indol y de sulfuro de
  hidrógeno en un mismo tubo.
• Es útil para diferenciar miembros de la familia
  Enterobacteriaceae.
• Es de color ámbar.

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AGAR SULFURO INDOL MOVILIDAD
Fórmula (en gramos por litro) Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Tripteína 20.0 Suspender 30 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar hasta disolver calentar agitando y hervir durante un minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de hemólisis y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Solidificar en posición vertical.
Peptona 6.1 Suspender 30 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar hasta disolver calentar agitando y hervir durante un minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de hemólisis y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Solidificar en posición vertical.
Sulfato de hierro y amonio 0.2 Suspender 30 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar hasta disolver calentar agitando y hervir durante un minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de hemólisis y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Solidificar en posición vertical.
Tiosulfato de sodio 0.2 Suspender 30 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar hasta disolver calentar agitando y hervir durante un minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de hemólisis y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Solidificar en posición vertical.
Agar 3.5 Suspender 30 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar hasta disolver calentar agitando y hervir durante un minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de hemólisis y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Solidificar en posición vertical.
pH final 7.3 0.2 pH final 7.3 0.2 pH final 7.3 0.2
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RESULTADOS

• Cepas móviles producen turbidez del medio, que
  se extiende mas allá de la línea de siembra.
• Cepas inmóviles el crecimiento se observa
  solamente en la línea de siembra.
• Cepas SH2 positivas ennegrecimiento a lo largo
  de la línea de siembra o en todo el medio.

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• Cepas SH2 negativas el medio permanece sin
  cambio de color.
• Cepas indol positivas desarrollo de color rojo
  luego de agregar el reactivo de Kovacs o de
  Erlich.
• Cepas indol negativas sin cambio de color.

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AGAR CITRATO DE SIMMONS

• Contiene citrato de sodio y fosfato de amonio
  como fuentes de carbono y de nitrógeno
  respectivamente
• Azul de bromotimol como indicador de pH.
• Sólo las bacterias capaces de metabolizar el
  citrato podrán multiplicarse en este medio y
  liberarán iones amonio lo que, junto con la
  eliminación del citrato (ácido), generará una
  fuerte basificación del medio que será aparente
  por un cambio de color de verde a azul.

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Fórmula (en gramos por litro)

• Citrato de sodio 2.0
• Cloruro de sodio 5.0
• Fosfato di potásico 1.0
• Fosfato monoamónico 1.0
• Sulfato de magnesio 0.2
• Azul de bromotimol l0.08
• Agar 15.0

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CALDO RM-VP

• Medio utilizado para la realización del ensayo de
  Rojo de Metilo y Voges Proskauer.
• Es particularmente útil para la clasificación de
  enteró bacterias.

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CALDO RM-VP
Fórmula (en gramos por litro) Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Pluripeptona 7.0 Suspender 17 g del polvo por litro de agua destilada. Calentar suavemente agitando hasta disolver. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121C durante 15 minutos.
Glucosa 5.0 Suspender 17 g del polvo por litro de agua destilada. Calentar suavemente agitando hasta disolver. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121C durante 15 minutos.
Fosfato dipotásico 5.0 Suspender 17 g del polvo por litro de agua destilada. Calentar suavemente agitando hasta disolver. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121C durante 15 minutos.
pH final 6.9 0.2 pH final 6.9 0.2 pH final 6.9 0.2
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REVELADO DE PRUEBAS BIOQUIMICAS

• Prueba del rojo de metiloAñadir unas gotas de
  una solución de rojo de metilo al 0.04, observar
  el color del medio.
• Prueba del Voges ProskauerAñadir 0,6 ml de
  alfa naftol al 5 en alcohol etílico absoluto y
  0.2 ml de hidróxido de potasio al 40 a 2.5 ml de
  cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a
  temperatura ambiente durante 10-15 minutos.
  Observar el color de la superficie del medio.

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RESULTADOS

• Prueba del rojo de metilo Positivo color
  rojo.Negativo color amarillo
• Prueba de Voges Proskauer Positivo desarrollo
  de un color rojo en pocos minutos después de una
  completa agitación del tubo.Negativo ausencia
  de color rojo.